甘 丽 吴学杰 申五一 刘友山 俞凯莉

(浙江中医药大学附属第三医院医学美容中心，杭州310003)

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是专职抗原提呈细胞，在固有免疫和适应性免疫应答中起重要作用。此外，它们是唯一能启动初始T细胞免疫应答的抗原提呈细胞[1]。目前，诱导未成熟DCs的体外培养方案已经很成熟[2-4]，并且开发了多种促进DCs成熟的方案，其中IL-1β、IL-6、TNF-α加前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)方案已成为“标准的”DCs促成熟方案[5]。但该方案促成熟DCs仅产生极少量的IL-12p70，而该细胞因子在诱导Th1类应答中具有重要作用，因此有必要开发新的促进DCs成熟的方案。有研究发现单用瑞喹莫德(Resiquimod，R848),可以刺激未成熟DCs产生较高水平IL-12p70[6]。此外，PEG2在促进成熟DCs迁移性方面发挥重要作用[7]。然而，同时给予R848和PGE2刺激后，未成熟DCs细胞表型和功能变化尚不清楚。在本研究中，我们采用R848联合PGE2刺激未成熟DCs，并与标准方案促成熟DCs进行比较，以确定该方案诱导的成熟DCs在表型和功能方面是否优于标准方案诱导的成熟DCs。

1 材料与方法

1.1材料 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)，CD14 Microbeads(Miltenyi Biotec)，AIM-V培养基(Gibco)，丝裂霉素C(Roche)，rh粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、rhIL-4、IL-1β、IL-6、TNF-α(PeproTech)，R848(Alexis)，Dextran-FITC、PGE2、豆蔻酰佛波醇乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和离子霉素(Sigma)，Annexin V-PE、7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)、Cytofix/Cytoperm kit、FITC-IFN-γ、PE-IL-4、CD40-FITC、CD86-FITC、CD80-PE、CD83-PE、CXCR4-PE、HLA-DR-Percp和相应的同型对照(BD Biosciences)，CCR7-FITC及同型对照(eBioscience)，CellTiter 96®AQueous无放射性试剂(Promega)，ELISA试剂盒(Biolegend)，FlowJo 软件(版本 5.7.2，Tree Star Inc.)。FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)，二氧化碳细胞孵育箱和生物安全柜(中国香港力康生物公司)。

1.2方法

1.2.1分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)后用磁珠分选CD14+单核细胞 使用Ficoll-Paque Plus梯度离心法从健康人外周血(外周血来自课题组成员，每次血量约20 ml)分离PBMCs。然后用人CD14+磁珠从PBMCs中分选CD14+单核细胞。CD14+单核细胞分选纯度大于90%。

1.2.2培养DCs CD14+单核细胞重悬于含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的无血清AIM-V培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。2 h后，吸弃培养液并加入含人重组GM-CSF(1 000 U/ml)和IL-4(500 U/ml)的AIM-V，隔2 d半量换液，第5天时分别加入促成熟因子IL-1β、IL-6、TNF-α(均为1 000 U/ml)加PGE2(1 mg/L)和R848(5 mg/L)加PGE2(1 mg/L)继续培养2 d。

1.2.3流式细胞检测分析 成熟DCs用如下抗体进行标记:FITC标记的CD40、CD86和CCR7，PE标记的CD80、CD83和CXCR4以及Percp标记的HLA-DR和相应的同型对照。采用FACS Calibur进行检测，数据用FlowJo 软件进行分析。

1.2.4DCs吞噬能力检测 成熟DCs以及培养相应天数的未成熟DCs与FITC-dextran(1 g/L)在37℃或4℃(阴性对照)孵育6 min。然后用冷PBS洗3遍，采用FACS Calibur进行检测，数据用FlowJo 软件进行分析。

1.2.5成熟DCs凋亡检测 成熟DCs用凋亡检测试剂Annexin V和7-AAD进行标记后，采用FACS Calibur进行检测，数据用FlowJo 软件进行分析。

1.2.6混合淋巴细胞反应 成熟DCs先用50 mg/L 丝裂霉素C处理45 min，然后用PBS洗3遍，再与去除了CD14+单核细胞的异体PBMCs(2×105)以1∶10的比例在96孔板中共培养4 d。随后各孔加入CellTiter 96®AQueous无放射性试剂20 μl继续培养4 h，然后用酶标仪在490 nm波长检测。

1.2.7细胞因子检测 采用ELISA试剂盒检测成熟DCs上清中细胞因子IL-12p40、IL-12p70和IL-10的分泌情况。

1.2.8Th1/Th2细胞反应检测 未成熟和成熟DCs与自体去除CD14+单核细胞的PBMCs以1∶10比例种于24孔培养皿中。单独培养的T细胞作为对照。共培养7 d后，PBMCs用PMA(300 ng/ml)和离子霉素(1 μg/ml)刺激1 h后，再加入 GolgiStop 处理5 h。收集上述处理的细胞并用PBS洗2次，再加入APC-CD3和PerCP-CD8在暗室中孵育20 min。随后，再加入Cytofix/Cytoperm试剂固定和细胞膜打孔，最后加入FITC-IFN-γ 和PE-IL-4 染色。Th1和Th2细胞分别定义为CD3+CD8-IFN-γ+T细胞和 CD3+CD8-IL-4+T细胞。采用FACS Calibur进行检测，数据用FlowJo 软件进行分析。

1.3统计学方法 所用软件为SPSS13.0(SPSS Inc,Chicago,IL)，采用Mann-WhitneyU检验分析组间差异，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1成熟DCs表型特征 R848联合PGE2和IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs中CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR阳性DCs频率相似，均达到90%以上。另外，两种方案促成熟DCs表达CXCR4的水平也相似，分别为59.9%和56.8%，而R848联合PGE2促成熟DCs表达CCR7的水平高于IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs(表1)。

2.2DCs存活率和吞噬能力 细胞凋亡检测显示，两种方案促成熟DCs中Annexin V和7-AAD双阴性细胞(即活细胞)的比例相似，分别为94.92%和92.83%。此外，和未成熟DCs相比，两种方案促成熟DCs吞噬能力均显著下降，分别为3.39%和2.06%(图1)。

表1 成熟DCs表型特征

Tab.1 Phenotypic characteristics of mature DCs

Surface markerIL-1β,IL-6,TNF-α and PGE2R848 and PGE2CD4094.7%90.3%CD8097.8%98.1%CD8393.1%95.5%CD8699.9%99.9%HLA-DR99.8%99.8%CXCR459.9%56.8%CCR713.0%31.2%

Note：One of three independent results is indicated.

图1 不同方案促成熟DCs存活率(A)和不同方案促成熟DCs吞噬能力(B)Fig.1 Viability of DCs matured by different procedures(A)and endocytic capacity of DCs matured by different procedures(B)Note: A.The double positive DCs of PE-A5 and 7-AAD are survival cells;B.The value in the figure represents phagocytosis ability.One of three performed experiments is presented.

2.3混合淋巴细胞反应 两种方案促成熟DCs与去除了CD14+单核细胞的异体PBMCs(2×105)以1∶10的比例共培养4 d，用CellTiter 96®AQueous无放射性试剂进行检测，结果显示OD值(490 nm)分别为0.61和0.53(P>0.05)(图2)。说明R848联合PGE2促成熟DCs和IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs刺激异体T细胞增殖的能力相似。

2.4成熟DCs产生细胞因子IL-12p40、IL-12p70和IL-10的水平 两种方案促成熟DCs均可产生高水平IL-12p40，分别为814.52 pg/ml和1447.96 pg/ml；而R848联合PGE2促成熟DCs产生IL-12p70的水平明显高于IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs，分别为373.91 ng/L 和3.17 ng/L；另外两种方案促成熟DCs都产生较低水平IL-10，分别为6.12 ng/L和30.61 ng/L(图3)。

图2 混合淋巴细胞反应结果Fig.2 Results of mixed lymphocyte reactionNote: *.P>0.05.

图3 不同方案促成熟DCs产生细胞因子的结果Fig.3 Results of cytokine production secreted by different procedures matured DCsNote: A,B and C was the result of IL-12p40,IL-12p70 and IL-10 production secreted by different procedures matured DCs respectively.DCs matured by R848 plus PGE2 produced higher levels of IL-12p40,IL-12p70 and IL-10.Results of cytokine production are presented as mean of two independent experiments.

图4 不同方案促成熟DCs诱导Th1/Th2反应的能力Fig.4 Capacity of DCs to induce Th1/Th2 responsesNote: Th1 was defined as CD3+CD8-IFN-γ+T cells and Th2 was defined as CD3+CD8-IL-4+T cells.One of three independent results is indicated.

2.5DCs诱导Th1/Th2细胞反应的能力 R848联合PGE2促成熟DCs诱导表达IFN-γ的CD3+CD8-T(Th1)细胞的频率高于IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs，但统计学上无显著差异(P>0.05)。然而，两种方案促成熟DCs无法诱导表达IL-4的CD3+CD8-T(Th2)细胞反应(图4)。

3 讨论

在本研究中，我们通过对R848联合PGE2和IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs进行比较后发现，两种方案促成熟DCs主要表型和功能相似，但R848加PGE2促成熟DCs表达CCR7的水平较高，产生IL-12p40和IL-12p70的量也更多。

本研究中两种方案促成熟DCs均高表达CD83，提示DCs充分成熟，而重要的共刺激分子CD80和CD86[8]表达频率也均超过90%。此外，两种方案促成熟DCs也高表达另一个重要的促进T细胞活化的表面分子CD40[9，10]。尽管两种方案促成熟DCs表达CXCR4的水平相似，但R848加PGE2促成熟DCs表达CCR7的水平明显高于IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs，而CCR7在成熟DCs迁移至淋巴结中起重要作用[11，12]。

DCs存活率对于DCs发挥功能十分重要，本研究中两种方案促成熟DCs的存活率均超过90%。高存活率可能与促成熟方案中PGE2有关，已有研究显示PGE2可以促进DCs存活[13，14]。另外，两种方案促成熟DCs刺激异体T细胞增殖的能力也相似。虽然两种方案促成熟DCs均可产生高水平IL-12p40，但是R848加PGE2促成熟DCs产生具有生物活性的IL-12p70的水平更高，而大量的研究已证实IL-12p70在诱导Th1应答中具有重要作用[15-17]。尽管R848加PGE2促成熟DCs产生IL-12p70的水平较高，但该方案促成熟DCs诱导Th1细胞反应的水平并未显著高于IL-1β、IL-6、TNF-α联合PGE2促成熟DCs。其原因可能是R848加PGE2促成熟DCs也可产生较高水平IL-10，抑制了Th1细胞反应。研究发现，IL-10在负向免疫调节中具有重要作用，可通过抑制自噬调节DCs功能发挥作用[18]。

该研究结果表明，两种方案均可明显促进DCs成熟，但R848联合PGE2促成熟DCs表达CCR7和产生IL-12p40和IL-12p70的水平更高，可能有助于进一步提高基于DCs的免疫疗法的疗效。