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基于代谢组学研究新生儿黄疸患者及对蓝光治疗的反应

2019-08-13池敏珊柯美容张晓敏

中国医学创新 2019年16期
关键词:代谢组学新生儿黄疸

池敏珊 柯美容 张晓敏

【摘要】 目的:探讨新生儿黄疸患者光照前后血清代谢谱学变化,为进一步研究新生儿黄疸和光疗反应代谢谱学提高依据。方法:选取本院30例新生儿黄疸患者为新生儿黄疸组,25例健康新生儿为正常对照组。运用核磁共振(NMR)的代谢组学方法来研究生儿黄疸组光疗前后与正常对照组的血清代谢谱差异。数据通过多因素的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行处理。结果:依据PCA和OPLS-DA模型鉴别,新生儿黄疸组与正常对照组比较有缬氨酸、肌醇、赖氨酸、亮氨酸等10种代谢物存在差异;新生儿黄疸组治疗前后有β-葡萄糖、α-葡萄糖、缬氨酸、酪氨酸等28种代谢物存在差异。结论:新生儿黄疸患者的代谢紊乱,且光疗对脂质、氨基酸和能量代谢的影响具有重要的作用。

【关键词】 新生儿黄疸; 光疗法; 代谢组学; 核磁共振波谱

【Abstract】 Objective:To explore the changes of serum metabolic spectrum in neonatal jaundice patients before and after illumination,and to improve the basis for further study of neonatal jaundice and phototherapy response metabolic spectrum.Method:A total of 30 neonatal jaundice patients were selected as neonatal jaundice group and 25 healthy neonates as normal control group.The metabolomics method of nuclear magnetic resonance(NMR)was used to study the difference of serum metabolic spectrum between Jaundice group and normal control group before and after phototherapy.Data were processed by principal component analysis(PCA)and orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA).Result:According to the identification of PCA and OPLS-DA models,there were 10 metabolites such as valine,inositol,lysine and leucine in the neonatal jaundice group compared with the normal control group,there were 28 metabolites such as β-glucose,α-glucose,valine and tyrosine in the neonatal jaundice group before and after treatment.Conclusion:Metabolic disorders in neonatal jaundice patients,and the effects of phototherapy on lipid,amino acid and energy metabolism play an important role.

【Key words】 Neonatal jaundice; Phototherapy; Metabonomics; Nuclear magnetic resonance spectroscopy

First-authors address:Nanshan Peoples Hospital,Shenzhen 518052,China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2019.16.003

黃疸是一种新生儿最常见的疾病。据估计,大约60%的足月婴儿和80%的早产儿在出生后的第1周出现黄疸[1-2]。光疗通常被认为是一种安全和耐受性良好的治疗新生儿黄疸的方法,可以将胆红素转化为水溶性的异构体,很容易通过胃肠道或尿液丢失消除[3-4]。胆红素在460 nm波长附近的蓝色区域吸收最强烈的光,氮化镓光致发光二极管(LED)可提供高强度的窄波长光谱光,已被越来越多地用于治疗新生儿黄疸[5-6]。虽然光疗可有效治疗新生儿黄疸,但很少有评估光疗有效性的生物标志物,2004年美国儿科学会发布的光疗指南,主要是参考血清总胆红素(TSB)水平的高低[7]。标准治疗新生儿黄疸是测量TSB水平,常用的化学方法对胆红素的测量是基于一个偶氮化合物或对胆红素-胆红素氧化酶氧化为胆绿素分子氧胆红素的耦合,但其均受溶血干扰[8]。因此,笔者通过分析新生儿黄疸患者光疗前、后的血清的整个代谢谱的变化,进一步阐明光疗的作用机理。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年3月-2012年11月本院收治的30例新生儿黄疸患者为新生儿黄疸组,25例健康新生儿为正常对照组。(1)纳入标准:胎龄>35周;新生儿黄疸患儿均表现出全身皮肤黏膜黄染和不同程度面目黄染,入院时血清总胆红素均>15 mg/dL,均以血清未结合胆红素明显升高为主。(2)排除标准:新生儿临床表现为重度黄疸(血清总胆红素均>25 mg/dL);新生儿伴有溶血,需要换血(出生时脐血总胆红素>4 mg/dL);新生儿血红蛋白<120 g/L;新生儿伴有水肿、肝脾大和心力衰竭等疾病。患儿监护人均同意参加此项研究,且经本院伦理委员会批准,在整个研究过程中,遵守赫尔辛基主体医学研究的伦理原则宣言。

1.2 方法 (1)新生儿黄疸组接受光疗标准:依据新生儿出生天数和由中华医学会儿科学会制定的TSB水平[9]。运用头顶的LED光疗系统[Tende Electronics & Software Ltd.Company,Ankara,强度:30~120 μW/(cm2·nm),光谱400~470 nm]进行光疗。采集静脉血,3 000 g离心5 min,收集血清,于-80 °C,用以实验分析。(2)样品的核磁共振(NMR)分析:在NMR实验前,冷冻血清室温下解冻20 min,离心后取上层血清400 μL并加至5 mm的核磁管中,加入100 μL的生理盐水(0.9% NaCl 10%/90% H2O和D2O),12 000 g离心5 min,取400 μL等分溶液放入另一个5 mm的核磁共振管用以核磁共振实验。1H NMR实验所用仪器是Varian 600谱仪,其1H共振頻率是599.93 Hz。横向弛豫加权实验是用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列,弛豫延迟2.1 s,采集时间1.000 0 s,谱宽8 000.0 Hz,温度25 ℃,总回波时间100 ms,累加次数128次。

1.3 观察指标及评价标准 (1)分析新生儿黄疸蓝光治疗前后及正常对照组的血清代谢物,血清代谢物的分析运用主成分分析方法(PCA),降低数据的维数和通过主成分分析图谱,概括核磁共振光谱使用分数间的相似点和不同点。(2)分析新生儿黄疸蓝光治疗前后及正常对照组代谢物的差异性,对偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)模型进行正交矫正处理,使用SIMCA-P+软件(V11.0,Umetrics AB,Umea,Sweden)进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异,即判定黄疸蓝光治疗前后及正常对照的差异[10-11]。

1.4 统计学处理 使用TopSpin软件(V3.0,Bruker Biospin,Germany)对血清核磁共振谱图进行傅立叶变换;数据分析使用SIMCA-P 11.0软件(Umetrics,Umea,Sweden)进行多元统计分析,对检测获得的1H NMR谱进行分段积分,并去除水峰及因交叉弛豫引起峰型变宽后,将所产生的所有积分数据归一化后,对余下的血清谱图积分谱图积分分别进行PCA分析;通过OPLS-DA分析各代谢物相应的相关系数(r),对有统计意义的代谢物进行进一步归纳,将每一个变量的系数加载值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换,然后与相应的r临界值表进行比对,得到组间差异的代谢物;使用SPSS 11.5软件(SPSS公司,芝加哥,伊利诺斯州,美国)对所得数据进行统计分析,正态分布计量资料用(x±s)表示,组间比较采用t检验,组内比较采用配对t检验,非正态分布计量资料用[M(P25,P75)]表示,比较采用秩和检验;计数资料以率(%)表示,比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床和实验室资料比较 两组出生体重、孕龄、性别、治疗前年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性;新生儿黄疸组治疗前总胆红素浓度高于正常对照组,且治疗后总胆红素浓度低于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.2 主成分分析 新生儿黄疸蓝光治疗前后及正常对照组2D的PCA分析图显示,尽管组间存在一些交叉部分,并用交叉验证后得到的R2X和Q2Y(分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度)对模型有效性进行评判,即R2X=0.824,Q2Y=0.895;Q2Y的预测值为0.807,见图1。

2.2 正交偏最小二乘判别分析 OPLS-DA图显示,对照组和蓝光治疗前的新生儿黄疸组代谢物质存在差异,其中R2X=0.287,Q2Y=0.843;Q2Y的预测值为0.698,见图2;新生儿黄疸组蓝光治疗前后的代谢物质存在差异,其中R2X=0.2238,Q2Y=0.809,Q2Y的预测值为0.753,见图3;依据r临界值(|r|>0.330),新生儿黄疸组治疗前后有28种代谢物存在差异,新生儿黄疸组治疗后β-葡萄糖、α-葡萄糖、缬氨酸、酪氨酸、三甲胺、丙酮酸、磷酸胆碱、肌醇、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘油磷酸胆碱、谷氨酸盐、丙氨酸、1-甲基组氨酸均低于治疗前,乳酸、脂类、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、甘氨酸、谷氨酰胺、丙酮、乙酰乙酸乙酯、3-羟基丁酸酯均高于治疗前,见表2;新生儿黄疸组与正常对照组比较有10种代谢物存在差异,新生儿黄疸组治疗前缬氨酸、肌醇、赖氨酸、亮氨酸、乳酸、异亮氨酸、甘氨酸、肌酸、丙氨酸高于正常对照组,低密度脂蛋白低于正常对照组,见表2。

3 讨论

总胆红素作为诊断新生儿黄疸的标准和评价蓝光治疗的效果的一项重要指标[12],本研究基于NMR实验的代谢组学研究方法,对蓝光治疗前后的新生儿黄疸患者的血清进行了分析,并发现了一些新的低分子量的生物标记物。

本研究结果显示,与正常对照组比较,新生儿黄疸组治疗前缬氨酸、肌醇、赖氨酸、亮氨酸、乳酸、异亮氨酸、甘氨酸、肌酸、丙氨酸增加,低密度脂蛋白减少,表明在新生儿黄疸患者血清中的缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甘氨酸的升高,反映了其氨基酸代谢是紊乱的。众所周知,乳酸是糖酵解中的终产物,且最近有许多科学家发现在新生儿高黄疸症患者的乳酸的改变[13]。而肌酸是一种含氮的化合物,其主要在人体的肝脏中合成,作为一个能量调节线粒体和细胞质之间的ATP产量[14],因此,笔者推测高浓度的肌酸可肝脏细胞功能紊乱。另外,新生儿黄疸患者的血清中的低密度脂蛋白的含量是减少的,早期研究证实,胆红素具有抗动脉粥样硬化的特性和与血清中的脂质成分呈负相关[15]。因此,以上提及的代谢组学的发现可以作为诊断新生儿黄疸重要生物标记物。

本研究结果显示,新生儿黄疸患者接受蓝光治疗前后共有28种代谢物质发现差异性的改变,13种代谢物质变化是增加的,其中乳酸和脂质变化显著,另有15种代谢物质是变化是减少的,其中糖和氨基酸的变化显著,大多数的代谢物质主要与氨基酸和糖代谢相关,蓝光治疗后的新生儿黄疸患者血清中,β-葡萄糖和α-葡萄糖的含量均是明显减少的(r=-0.666、-0.658),这一结果充分说明了蓝光治疗会直接影响新生儿黄疸患者的能量代谢,而健康婴儿的代谢变化没有发生改变,此研究的结果是一定的探索性。因此,蓝光治疗组的代谢变化可能与后天成熟或喂养的结果有关。

一项早期研究发现,新生儿黄疸患者接受蓝光治疗后,其血流会增加,这可能与消耗能量和葡萄糖的水平下降有关[16]。这就更好地解释了新生儿黄疸患者在接受蓝光治疗后,其血清中β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平下降的原因。本研究结果显示,丙酮酸水平减少(r=-0.346)、乳酸水平增加(r=0.599),乳酸是糖酵解的终产物,而丙酮酸是在糖酵解阶段产生乳酸前的一个中间产物,当机体急需要能量时,丙酮酸可以通过糖酵解途径产生更多的ATP能量,这样导致产生了更多的乳酸。另一方面,在婴幼儿时期,机体具有维持糖自稳的重要能力[17-18],以上提及的代谢组学特性显示蓝光治疗新生儿黄疸患者可以导致其β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平下降,从而引起新生儿机体增加糖异生来维持血糖水平。本研究中,生糖氨基酸包括缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸的降低,笔者推测这些氨基酸为转化葡萄糖来维持血糖平衡。此外,作为葡萄糖的异构体,肌醇的含量保持一个较低的水平。因此,笔者认为光疗不仅能加速胆红素的代谢,而且能导致糖代谢的改变。

本研究还显示,患儿治疗后的血脂水平(如低密度脂蛋白)在光疗后显著升高,与Yoshino等[19]研究一致,说明总胆红素与低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白呈负关联的。在本研究中,显著降低的血脂如低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白,考虑为新生儿黄疸光疗后的患者可能通过光动力应激可引起脂质过氧化作用。然而,谢辉等[20]观察胆红素水平与HDL-C水平呈正相关,但笔者没有观察到在蓝光治疗后的高密度脂蛋白的显著性变化,这可能是由于本研究中的样本数少有关。

胆红素暴露在光下,可以转化为水溶性异构体。然而,异构体的代谢具体机制目前沿不清楚。在本研究中,笔者采用基于NMR的代谢组学方法研究新生儿黄疸患者血清代谢谱分析,显著性差异的代谢物可能对阐明的光疗作用的详细机制和用以诊断和监测治疗新生儿黄疸患者提供了重要的生物标志物,而关于健康婴儿后续检测需要更多的相关研究。

综上所述,新生儿黄疸患者的代谢紊乱,且光疗对脂质、氨基酸和能量代谢的影响具有重要的作用。

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(收稿日期:2018-05-18) (本文編辑:董悦)

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