王庆容　徐晓舒　王林先

摘要：研究中草药复合饲料中五倍子鞣质在猪体内的药代动力学特征和残留规律，以期进行更加有效的疾病防治和得出明确的禁药期。采用含有五倍子的中草药复合饲料1和复合饲料2饲喂猪，分别于0、4、8、12、24、48、96 h后取血液、肝脏、肾脏、胃、小肠、脑等组织，用高效液相色谱检测各组织中没食子酸的含量。在猪的血液、肝脏、肾脏、胃、小肠、脑等组织中，4、8、12、24、48 h后均检测到了没食子酸，但在96 h后几乎检测不到没食子酸，结果表明，没食子酸在96 h后已基本代谢完毕。

关键词：没食子酸;高效液相色谱;药代动力学

中图分类号： R285  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0138-05

五倍子是我国传统的中药，其有效成分能凝固微生物体内的原生质及多种酶，具有抗菌、抗病毒、清除自由基和抗氧化等作用。五倍子作为传统中药，有解毒、止血、敛疮、涩肠、敛肺、止汗之功效;按其药理还有抑突变、癌化学预防等作用[1]。五倍子在我国四川、贵州、陕西、云南、湖南、湖北6省产量较高，占全国总产量的90%以上，另外，河南、甘肃、广东、浙江、安徽、福建、江西、山西等地亦产[2]。

鞣质为五倍子的主要成分，含量可达60%～70%，它是葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的酯类化合物的混合物[3]。鞣质是一类混合物，在酸性条件下，鞣质可水解成没食子酸，两者成正比关系，通过测定其中的没食子酸含量，可反映鞣质的多少[4]。没食子酸是白色或微黄色针状晶体，常温时（25 ℃）微溶于水，易溶于沸水、乙醚、丙酮等，不溶于三氯甲烷、苯等有机溶剂[5]。没食子酸具有强还原性，遇空气中的氧变成褐色，还可与蛋白质、凝胶、重金属、生物碱等结合。它是植物体中一类次生代谢产物，以游离酸或形成酯类化合物的形式存在于五倍子、茶、没食子等植物中，属于低毒物质。经由没食子酸生成的没食子酸丙酯、次没食子酸铋等多种衍生物，可用于食品、制药及轻工行业[6]。

在检测药物含量的众多方法中，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）是有效的方法之一，它具有简便、快速、灵敏度高、专一性强和重复性好的优点，应用非常广泛。因此，利用高效液相色谱法对猪各组织中不同时段没食子酸含量进行检测，观察其代谢动态变化过程，可以为养殖业以及中草药复合饲料的生产、安全使用和推广提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

将黄连、五倍子、姜、石菖蒲、紫苏、连翘、黄芩等中草药按一定比例混合，按1%的质量分数添加到普通饲料中混合成中草药复合饲料1（用F1表示），按2%的比例添加到普通饲料中混合成中草药复合饲料2（用F2表示），于2016年春季在遵义市沙湾镇尚窝沟养殖场选择30头质量约为50 kg的（长白）猪，随机分为2组，先用普通饲料饲喂15 d。禁食 12 h，不禁水。之后分别饲喂中草药复合饲料1和中草药复合饲料2各1次，在此期间禁食不禁水。24 h后全部转为饲喂普通饲料。从饲喂复合饲料开始，分别于0、4、8、12、24、48、96 h后每组随机选择1头猪屠杀，取血液、肝脏、肾脏、胃、小肠、脑等组织，放入液氮中运回实验室，保存在-80 ℃的冰箱中备用。

1.2 仪器与试剂

主要仪器：岛津高效液相色谱仪（LC-20A）、恒温柱箱、自动进样器、超声波清洗机（SB-120D，宁波新芝生物科技股份有限公司）、AR2224CN电子分析天平、循环水真空泵（SH2-ⅢD，上海亚荣生化仪器厂）、旋转蒸发仪（RE52CS-1，上海亚荣生化仪器厂）、容量瓶、微量移液器、研钵、0.22 μm 滤膜。主要试剂：甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）、乙醚、没食子酸标准品（南通飞宇生物制备，供含量测定用）、纯水和超纯水（密理博超纯水器）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 根据盛达成等的色谱条件进行改良[7]，将有机相换为甲醇，流动相设为甲醇、水（体积比为80 ∶ 20）。色谱柱为InertSustain C18/phenvlhexvl柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），检测波长为254 nm，泵A流速为0.20 mL/min，泵B流速为 0.80 mL/min，柱温为25 ℃，进样体积为20 μL。

1.3.2 样品的制备 分别称取各个组织2 mg，加入20 mL甲醇和1 mL乙醚充分研磨后，浸泡2 h，超声抽提30 min[8]，最后将研磨液于12 000 r/min离心15 min，离心后吸取上清液，即得样品，将提取好的样品放入4 ℃冰箱保存，待测。

1.3.3 標准品的制备 标准品的制备参照杜瑞莲等的方法[4]，称取没食子酸标准品4.15 mg于20 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解稀释并定容，摇匀，配制成浓度为215 μg/mL的没食子酸母液，放置在4 ℃冰箱中待用。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

吸取浓度为215 μg/mL的标准品溶液0.6、1.2、2.4、5.0、7.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释定容，得到浓度分别为12.9、25.8、51.6、107.5、150.5 μg/mL的标准液，用HPLC法进行检测分析。以峰面积（y）对浓度（x）进行统计回归，得到回归方程为y=315 527x-2 923 157，r2=0.999，RSD（相对标准偏差，relative standard deviation）=082%（n=5），没食子酸在12.0～200.0 μg/mL范围内线性关系良好，详见图1。

2.2 样品检测的色谱图

将制备好的各个样品溶液，经0.22 μm的微孔滤膜过滤到进样瓶中，按上述“1.3.1”节的色谱条件用HPLC法进行检测分析，得出各组织中没食子酸的峰分离情况良好，各个组织中五倍子鞣质保留时间均为10～12 min，与没食子酸标准品曲线的保留时间大致相同，符合定性分析的要求，所以用高效液相色谱法能够准确地测出猪体内五倍子鞣质的含量。用上述试验过程对各组织进行处理，重复测定3次，流动相色谱峰的峰形及结果的重现性均很好，RSD值均不超过5%，符合没食子酸代谢的特点，在不同组织中的代谢色谱结果见图2。将3次测定的各图峰面积平均值代入回归方程中，得到没食子酸的含量见表1、表2。

2.2.1 没食子酸在不同组织中的代谢状况 0 h时，各个组织中都没有检测到没食子酸，说明普通饲料中没有没食子酸或含有能分解没食子酸的物质。在血液中，4～12 h后没食子酸的含量逐渐增多，在12 h时达到吸收高峰，48 h后血液中没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到;在肝脏中，4～8 h 后没食子酸的含量逐渐增多，8 h时达到高峰，48 h后没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到;在胃中，4～8 h后没食子酸的含量逐渐增多，8 h时达到高峰，48 h后没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到;在肾脏中，4～12 h后没食子酸的含量逐渐增多，在12 h时达到高峰，48 h后没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到;在小肠中，4～12 h时肠壁中没食子酸的含量逐渐增多，在12 h时达到高峰，48 h后没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到;在脑中，4～12 h 时没食子酸的含量逐渐增多，在12 h时达到吸收高峰，48 h后没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到（图3-A）。在96 h后，各组织中几乎检测不到没食子酸，说明此时没食子酸在猪体内基本代谢完毕。比较图3-A和3-B，没食子酸的代谢曲线基本一致，说明猪对没食子酸的吸收是比较恒定的，与饲料中没食子酸含量不成正比关系，饲料中过多的没食子酸可能随粪便或尿液排出体外，但本研究没有对粪便或尿液进行没食子酸含量的检测。

2.2.2 没食子酸在不同时段的代谢状况 没食子酸在猪体内不同时段的代谢状况如下：在4～12 h时，在肝脏中的含量最高，在血液中的含量最低;在24 h时，F1在肝脏中的含量最高，F2在肾脏中的含量最高，血液中的含量最低;在48 h时，在肾脏中的含量最高，血液中的含量最低（图4-A和4-B）。

3 讨论

3.1 没食子酸在不同组织中的代谢状况

在血液、肾脏、肠壁、脑中，4～12 h后没食子酸的含量逐渐增多，在12 h时达到吸收的高峰，48 h后血液中没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到;在肝脏和胃中，4～8 h没食子酸的含量逐渐增多，8 h时达到高峰，48 h后没食子酸的含量变得很低，96 h后未检测到，详见图3-A和3-B。在96 h时，几乎检测不到没食子酸，说明此时没食子酸在猪体内基本代谢完毕。

3.2 没食子酸在不同时段中的代谢状况

在4、8、12 h时，没食子酸在肝脏中的含量最高，在血液中的含量最低。在24 h时，F1在肝脏中的含量最高，在血液中的含量最低;F2在肾脏中的含量最高，在血液中的含量最低。在48 h时，没食子酸在肾脏中的含量最高，在血液中的含量最低，此时没食子酸在肾脏中的含量最高是因为没有代谢完的没食子酸要通过肾脏排出体外，详见图4-A和4-B。

综上所述，猪在饲喂F1和F2饲料后，没食子酸在血液中的含量最少，可能是因为没食子酸微溶于水，难于被吸收进入血液中。金石等分析大鼠血浆中儿茶素主要代谢产物没食子酸含量，认为茶多酚中儿茶素在血浆中仅有少量的代谢产物没食子酸，可能由于儿茶素极性极强，水溶性高，难于被吸收进入血液，因此代谢产物也比较少[9]，本研究结果与之相似。

4 结论

中草药具有天然、高效、毒副作用少、资源丰富等优点，含有与动物免疫功能密切相关的生物碱、多糖、皂苷、蒽醌类、挥发油和有机酸等[10]。五倍子是具有很高的实用价值和经济价值的林产品，它是产生单宁酸、没食子酸、焦性没食子酸、藥用鞣质等一系列化工产品的主要原料。这些化工原料用在医药工业中， 能够生产多种药物。鞣质具有与抗菌素相等的抑制细菌的作用，同蛋白质络合能制成鞣酸蛋白，治疗肠道急性病症[11]。在饲喂中草药复合饲料4、8、12、24、48 h时，都检测到了五倍子鞣质;在96 h时，几乎检测不到没食子酸，说明此时没食子酸在猪的体内已经代谢完毕，试验结果表明，禁药期是96 h。

通过饲喂中草药复合饲料后，在猪的各个器官中都检测到了没食子酸，其中肝脏中含量最高。肝脏除了分泌胆汁、储存动物淀粉、调节蛋白、脂肪和碳水化合物的新陈代谢以外，还有解毒、造血和凝血的作用，肝脏还是最大的解毒器官，而五倍子也有解毒、止血的功效，这就增大了肝脏解毒功效，使猪的抵抗力提高，从而有效防止疾病的发生。而在我国五倍子分布较广，原料丰富，容易获得，这无疑为养殖业带来了很大的便利。

影响五倍子鞣质被猪体内组织吸收的因素还有很多，如能吃多少饲料、猪的体质及其代谢速率情况、水的pH值、操作过程和药品、试验仪器误差等皆是影响本试验结果的因素，给本试验带来极大的困难，进一步的成分系统分析鉴定和比较有待深入进行。

参考文献：

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[4]杜瑞莲，杨中林. 五倍子中鞣质提取工艺研究[J]. 中成药，2008，30（6）：839-841.

[5]张雅丽. 五倍子没食子酸的制备，抑菌作用及机理研究[D]. 西安：陕西师范大学，2014.

[6]张雅丽，李建科，刘 柳，等. 五倍子没食子酸研究进展[J]. 食品工业科技，2013（10）：386-390.

[7]盛达成，陈 凌，王文茂，等. 高效液相色谱法同时分析五倍子提取物中的没食子酸和鞣花酸[J]. 中国农学通报，2013，29（4）：148-154.

[8]李红然，付大友，李艳清，等. 超声微波协同萃取-HPLC测定五倍子中的没食子酸含量[J]. 化工时刊，2011，25（1）：36-38，41.

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[11]聂秀丽. 发挥我省五倍子资源优势的几个问题[J]. 贵州社会科学，1986（7）：41-44.姜兴粲，李 冰，孙继超，等. 添加防腐剂的五氯柳胺混悬液抑菌效力的检测与评价[J]. 江苏农业科学，2019，47（3）：143-145.