郝桂英 易利 潘用清

摘要    为探究山羊源枝睾阔盘吸虫的种内遗传变异和系统发育关系，对采集自四川省凉山州的5个吸虫样品nad4基因部分序列进行PCR扩增、序列测定及分析，并构建种系发育树。测序结果显示，所测得的5个山羊源枝睾阔盘吸虫nad4基因部分序列长度均为789 bp，核苷酸同源性为99.5%～100.0%，共检测到4个单倍型、4个变异位点。系统发育树显示，5个山羊源枝睾阔盘吸虫凉山州分离株聚在同一小支上，未与胰阔盘吸虫聚类在一支上，能与其他吸虫相鉴别。本研究结果为枝睾阔盘吸虫的分子分类和种群遗传的进一步研究奠定了基础。

关键词    枝睾阔盘吸虫;山羊;nad4基因;种系发育

中图分类号    S8-05        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）12-0200-02

Abstract    In order to study the genetic variations of Eurytrema cladorchis and the phylogentic relationships with other flukes，fragment of nad4 gene of 5 flukes isolated from Liangshan Prefecture in Sichuan Province were amplified by PCR，then analyzed the sequences，and the NJ tree was reconstructed.The results showed that the partial sequences of nad4 gene were 789 bp，with homology was 99.5%～100.0%，four haplotypes were detected in these sequences，with 4 variable sites.The phylogenetic tree showed that the isolates of E. cladorchis from goats in Liangshan were clustered in the same clade，which were not cluster together with E. pancreaticum，can be identified with other flukes.The results of this study could provide the foundation for further research on the molecular classification and population genetics of E. cladorchis.

Key words    Eurytrema cladorchis;goat;nad4 gene;phylogenetic

枝睾阔盘吸虫（Eurytrema cladorchis）隶属于吸虫纲（Tr-ematoda）复殖目（Digenea）双腔科（Dicrocoeliidae）阔盘属（Eurytreama）[1]，在牛、羊等反刍动物胰腺胰管内均有寄生，但不如胰阔盘吸虫（E. pancreaticum）、腔阔盘吸虫（E. coel-omaticum）常见[2]。阔盘属吸虫致病力低，常常在尸体剖检或屠宰时发现。然而，它能導致动物生产性能降低，如体重减轻、产肉量减少，甚至死亡，给养殖业造成一定经济损失[3]。

对枝睾阔盘吸虫的初步鉴定可通过观察其形态学特征进行，但受环境、宿主等多种因素的影响，其可靠性、准确性受到一定的限制。DNA技术已被广泛应用于寄生虫的分类学研究，其中的DNA序列分析因操作简便、结果准确、信息丰富等成为种系发生学和分类学的重要研究工具之一[4]。

nad4基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位4基因的简称，是线粒体上进化速率较快的一个基因，利用它作遗传标记基因对寄生绦虫和线虫进行种群遗传和分类研究已有报道[5-6]。但目前关于枝睾阔盘吸虫分子分类的研究较少，仅见Mohanta等[7]对孟加拉共和国瘤牛源枝睾阔盘吸虫的18S rRNA和ITS2进行了研究，未见nad4基因用于枝睾阔盘吸虫分子鉴别的报道。

鉴于此，本研究对采自四川省凉山彝族自治州的5个山羊枝睾阔盘吸虫样品nad4基因部分序列（pnad4）进行PCR扩增和序列分析，并构建枝睾阔盘吸虫与其他吸虫的种系发育关系，从而明确nad4基因能否成为枝睾阔盘吸虫理想的遗传标记，以期为今后枝睾阔盘吸虫的分子分类、种群遗传结构研究奠定基础。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    供试仪器。电子天平（型号为FA2204N），购自瑞安市安特称重设备有限公司;高速离心机（型号为TDL-60B），购自上海安亭科学仪器厂;梯度基因扩增仪，购自德国Eppe-ndorf公司;水平电泳仪（型号为DYY-6C），购自北京市六一仪器厂;BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像分析系统（型号为1708195），购自美国伯乐公司。

1.1.2    供试试剂。蛋白酶K购自Merck公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GreenView核酸染料、柱式DNA胶回收试剂盒等均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2    试验方法

1.2.1   虫体的采集及保存。从四川省凉山彝族自治州自然感染的5只山羊胰管内采集枝睾阔盘吸虫样品，用灭菌生理盐水清洗干净，进行形态学鉴定后，分别编号为LS01～LS05，于-20 ℃条件下保存备用。同一只山羊分离出的枝睾阔盘吸虫为1个分离株。

1.2.2    枝睾阔盘吸虫虫体总DNA提取。从冷冻保存的5个山羊枝睾阔盘吸虫样品中分别随机取出1条，用剪刀剪碎并研磨，加入1 μg/μL SDS裂解液和10 μg/μL蛋白酶K，放入56 ℃水浴锅中消化过夜，然后将消化好的虫体悬液用酚/氯仿法[8]提取虫体总DNA，保存于-20 ℃条件下备用。

1.2.3    枝睾阔盘吸虫nad4基因扩增及序列测定。用Chang等[9]报道的引物进行枝睾阔盘吸虫nad4基因部分序列的扩增。由上海杰李生物技术有限公司合成引物序列，引物序列如下：nad4P1为5′-GTT TTG ATG TTT TTA TGA GT-3′;nad4P2为5′-CTA ATA TGA CGA ACC AGG AA-3′。PCR扩增体系为50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物nad4P1、nad4P2（10 pmol/μL）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同时，以ddH2O作空白对照。扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，45 ℃复性40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后72 ℃延伸6 min。反应结束后分别取5 μL PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统检测目的条带的大小。各PCR扩增产物经柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化后送上海杰李生物技术有限公司测序。

1.2.4    序列分析及系统进化分析。检索GenBank收录的部分吸虫的nad4基因序列并下载（表1），然后用Clustal X 1.81软件进行序列比对，MEGA 5.0软件分析碱基组成，基于p-distance模型计算遗传距离;用DNAstar 中的MegAlign程序进行序列同源性分析;用DnaSP 4.0软件计算单倍型数（ha-plotypes，H）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，Pi）、单倍型多样性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差异（average number of nucleotide differences，K）。以猪带绦虫（Taenia soli-um，AB086256）作为系统发育分析的外群，采用p-distance模型，用MEGA 5.0软件构建NJ树，并进行重复1 000次的自举检验（bootstrap test）。

2    结果与分析

2.1    枝睾阔盘吸虫nad4基因部分序列的特征和同源性比较

比对校正剔除多余序列后，本研究测得的5个枝睾阔盘吸虫凉山州分离株的nad4基因部分序列长度均为789 bp（占全长的61.7%），A+T碱基的平均含量为61.4%。5个测序序列均不存在碱基插入/缺失，其中保守位点785个，变异位点4个（简约信息位点、单变异位点各2个）。核苷酸变异位点主要发生在密码子第1位（占50%），第2位和第3位各占25%，且全为转换（3个A-G、1个C-T），无颠换。

5个枝睾阔盘吸虫凉山州分离株测序序列的同源性为99.5%～100.0%，碱基变异率为0～0.5%。5个测序序列与胰阔盘吸虫的同源性为85.8%～85.9%，与矛形双腔吸虫、中华双腔吸虫、華支睾吸虫、大片吸虫、鹿前后盘吸虫的同源性均低于70%。

2.2    遗传多样性分析

5个山羊源枝睾阔盘吸虫的nad4基因部分序列共检测到4个单倍型，遗传距离为0～0.005（平均遗传距离为0.003），与胰阔盘吸虫的遗传距离为0.402～0.406，与矛形双腔吸虫、中华双腔吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、鹿前后盘吸虫的遗传距离均≥0.493。5个测序序列总的单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）分别为0.900和0.002 53，平均核苷酸差异（K）为2.000。

2.3    系统发育分析

基于nad4基因部分序列构建的NJ树（图1）显示，5个山羊源枝睾阔盘吸虫凉山州分离株单独聚为一支，未与胰阔盘吸虫聚在一支上，而胰阔盘吸虫与中华双腔吸虫和矛形双腔吸虫聚类在同一小支上，与形态学分类的结果不一致。

3    结论与讨论

目前，对胰阔盘吸虫和腔阔盘吸虫的研究主要集中在虫体形态结构、发育过程及阔盘吸虫病的感染情况调查、诊断和综合防治等传统寄生虫学方面，分子水平的研究较少。

用于胰阔盘吸虫和腔阔盘吸虫分子分类的靶分子主要有18S rRNA[13-15]、ITS-2[15]，虽然已有胰阔盘吸虫线粒体基因组全序列的报道[9]，但并未见基于线粒体基因对胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫、枝睾阔盘吸虫等进行分析的报道。

本研究对测序获得的5个山羊源枝睾阔盘吸虫凉山州分离株的nad4基因部分序列进行分析，发现其核苷酸同源性为99.5%～100.0%，平均遗传距离为0.003，构建的进化树显示枝睾阔盘吸虫凉山州样品位于同一分支，与其他吸虫得到了很好地鉴别。

本研究对采集自凉山州山羊源的枝睾阔盘吸虫nad4基因的部分序列进行扩增和序列分析，结果表明，枝睾阔盘吸虫的nad4基因部分序列种内相对保守，种间差异加大，说明nad4序列片段可作为枝睾阔盘吸虫种间鉴定及种内遗传变异研究的标记。研究结果为进一步研究枝睾阔盘吸虫的分子分类、遗传变异奠定了基础。

4    参考文献

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