白涛敏,王洁英,刘 娜,李 瑞

(陕西省人民医院儿科,西安 710068;*通讯作者,E-mail:wangjieying@163.com)

过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一种常见的免疫性炎症疾病,多发于儿童时期。普遍认为,过敏性紫癜患儿体内免疫功能紊乱与其病理、临床表现等关系密切[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为18-25个核苷酸的内源性非编码RNA,可调控细胞增殖和分化等过程,参与多种疾病的发展过程。研究发现,miR-155可通过介导炎症反应、抗原提呈、T细胞分化等过程影响免疫反应[2]。Th17细胞分化依赖于miR-155,miR-155敲低的T细胞不能正常分化为Th17,研究证实,过敏性紫癜患儿外周血Th17/Treg失衡,参与该疾病的发生和发展[3]。本研究初步探讨miR-155能否通过调控Th17/Treg平衡参与过敏性紫癜的发生、发展。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2016-04～2017-10本院接收诊治的79例过敏性紫癜患儿为研究对象,其中男42例,女35例,年龄2-13岁,平均年龄(7.59±4.16)岁。纳入标准:①符合过敏性紫癜患儿的诊断标准[4];②首次发病;③未使用任何糖皮质激素等药物。另选取同时期在本院体检的60例健康儿童作为对照,其中男34例,女26例,年龄2-14岁,平均年龄(7.81±4.37)岁。过敏性紫癜患儿和对照组在年龄、性别等方面无显著差异,具有可比性。本研究经本院病理委员会批准同意,患者家属自愿签署知情同意书。

1.2 实验试剂和仪器

FACS Calibur流式细胞仪,Becton Dickimn公司。DU-800型紫外分光光度计,美国贝克曼库尔特公司。Trizol试剂,Invitrogen公司。逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自Fermentas公司。引物由北京奥科公司设计并合成。白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 血样采集 采集所有受试者清晨空腹静脉血6 ml,置于抗凝管中,分为2管,每管3 ml。取其中一管,采用密度梯度离心法分离单核细胞,用于检测Th17和Treg细胞比例。另一管离心(4 ℃,3 500 r/min,10 min),取上层血清,-20 ℃保存备用。

1.3.2 流式细胞术检测Th17和Treg细胞比例 参考文献方法[5],采用EPICS-XL流式细胞仪检测外周血Th17和Treg细胞。

1.3.3 qRT-PCR检测血清 采用Trizol法提取血清中总RNA,分光光度计检测RNA浓度和纯度。RNA溶液在260 nm和280 nm处吸光值的比值大于1.8。严格参照逆转录试剂盒操作说明,将RNA逆转为cDNA,以cDNA为模板进行扩增。引物序列见表1。反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,总共进行45个循环,72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法,以U6作为内参计算miR-155相对表达水平,以GAPDH为内参,计算RORγt和Foxp3 mRNA的相对表达水平。

1.3.4 酶联免疫吸附法检测相关细胞因子表达 取1.3.1中收集的血清,采用酶联免疫吸附法分别按照IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10和TGF-β1试剂盒说明书检测其表达水平。

表1 引物序列

Table 1 The primer sequences

引物 上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′)U6CACTGGGCCATGCTAATCTTCTCGTGCAGGGTCCGAGGTmiR-155CGAGAGGTAACATTCAACGCTGTCGTGCAGGGTCCGTGGAGAPDHTGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGTGGTGAAGACGCCAGTAGRORγtGCCAAGGCTCAGTCATGAGACCTCACAGGTGATAACCCCGFoxp3GCCAAGGCTCAGTCATGAGACCTCACAGGTGATAACCCCG

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 过敏性紫癜患儿和对照组外周血miR-155表达比较

过敏性紫癜患儿和对照组外周血miR-155表达水平分别为1.79±0.08和1.03±0.02。与对照组相比,过敏性紫癜患儿外周血miR-155表达水平显著升高(P<0.05)。

2.2 过敏性紫癜患儿和对照组Th17和Treg细胞比例比较

与对照组相比,过敏性紫癜患儿外周血Th17细胞比例显著升高(P<0.05),Treg细胞比例显著降低(P<0.05,见表2)。

组别nTh17细胞Treg细胞对照组600.49±0.184.86±0.73HSP组791.26±0.432.35±0.57 t13.02222.767 P0.0000.000

2.3 过敏性紫癜患儿和对照组Th17和Treg细胞相关转录因子比较

与对照组相比,过敏性紫癜患儿外周血Th17细胞转录因子RORγt显著升高(P<0.05),Treg细胞转录因子Foxp3显著降低(P<0.05,见表3)。

组别nRORγtFoxp3对照组601.06±0.021.04±0.03HSP组791.84±0.080.47±0.01 t73.734157.873 P0.0000.000

2.4 过敏性紫癜患儿和对照组Th17和Treg细胞相关的细胞因子比较

与对照组相比,过敏性紫癜患儿外周血Th17细胞相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均显著升高(P<0.05),Treg细胞相关细胞因子IL-10和TGF-β1均显著降低(P<0.05,见表4)。

2.5 过敏性紫癜患儿miR-155表达与各检测指标相关性

过敏性紫癜患儿外周血miR-155与Th17细胞比例、转录因子RORγt以及相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均呈正相关(P<0.05),与Treg细胞比例、转录因子Foxp3以及细胞相关因子IL-10和TGF-β1均呈负相关(P<0.05,见表5)。

组别nIL-6IL-17IL-22IL-23IL-10TGF-β1对照组603.15±0.426.59±3.166.13±3.4835.21±10.2589.46±20.1787.39±11.54HSP组795.29±0.6726.19±12.4319.38±7.6847.39±12.5854.19±14.2851.08±8.13 t-21.70311.91612.4226.11412.06721.756 P-0.0000.0000.0000.0000.0000.000

表5 过敏性紫癜患儿miR-155表达与各检测指标相关性

Table 5 Correlation between the expression of microRNA-155 and the detection indexes in children with Henoch-Schonlein purpura

指标 miR-155 rPTh17细胞0.4670.023RORγt0.5730.012IL-60.4920.018IL-170.5190.015IL-220.3710.041IL-230.3860.034Treg细胞-0.4910.019Foxp3-0.5760.011IL-10-0.6150.006TGF-β1-0.5830.009

3 讨论

miR-155是由23个核苷酸组成的短链非编码RNA,定位于人21号染色体,高表达于人胸腺、脾脏、肺等富含免疫细胞的器官。郭莹等[6]研究发现,免疫性血小板减少症患者外周血CD19+B细胞中miR-155表达水平明显上调,并且与B淋巴细胞功能和细胞内抗体的产生密切相关,参与免疫性血小板减少症的发病过程。Johansson等[7]研究发现,miR-155敲低的过敏性气道炎症小鼠表现出较低的炎症水平,miR-155是过敏性气道炎症中2型固有淋巴细胞和IL-33信号传导的关键调节因子。本研究结果显示,过敏性紫癜患儿外周血miR-155表达水平较对照组也显著升高,提示miR-155可能参与过敏性紫癜的发病过程。

Th17和Treg细胞均属于CD4+细胞亚群,Th17细胞可分泌IL-17等炎症细胞因子,促进机体内单核巨噬细胞等产生更多的趋化因子及炎症细胞因子,从而介导机体产生炎症反应以及自身免疫性疾病的发生[8]。RORγt作为Th17细胞的特异性转录因子,可调控Th17细胞的分化与功能。RORγt可与活化T细胞因子相互作用,抑制IL-2的生成,间接地促进Th17细胞表达。Foxp3是Treg细胞的特异性转录因子,转化生长因子TGF-β通过诱导Foxp3蛋白的表达,进而维持Treg细胞的数量和功能。机体内过量的IL-6不仅能够抑制TGF-β诱导的Foxp3表达,还能够促进RORγt表达,进而促进CD4+细胞分化为Th17细胞。Th17/Treg平衡是机体维持免疫稳态的重要因素,在多种炎性疾病和免疫性疾病中被广泛关注。张玲等[9]研究发现,过敏性紫癜患儿外周血Th17、Treg细胞及其关键调控因子IL-6、TGF-β等水平均较健康对照表达异常,Th17/Treg平衡失调可能参与该疾病的发病过程。本研究结果显示,与对照组相比,过敏性紫癜患儿外周血Th17细胞比例、转录因子RORγt、相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23显著升高,而Treg细胞比例、转录因子Foxp3、相关细胞因子IL-10和TGF-β1显著降低,与相关报道结果一致,提示过敏性紫癜患儿外周血Th17/Treg细胞呈平失调状态,通过调节Th17/Treg平衡可能为过敏性紫癜的治疗提供新方法或新思路。

Th17细胞的分化依赖于miR-155表达,多种免疫相关性疾病中miR-155表达异常与Th17细胞分化异常相关。Zhang等[10]研究发现,miR-155敲除的小鼠T细胞尤其是Th17细胞介导的炎症反应显著减弱,miR-155调节慢性心脏排斥反应中Th1/Th17相关的炎症,可能是减弱心脏移植排斥反应的潜在治疗靶点。本研究结果显示,miR-155与Th17细胞比例、RORγt、IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均呈正相关,与Treg细胞比例、Foxp3、IL-10和TGF-β1均呈负相关,猜测miR-155也可能通过调节Th17/Treg平衡参与过敏性紫癜发生过程,是该疾病的潜在治疗靶标。

综上所述,过敏性紫癜患儿外周血miR-155过表达,Th17/Treg细胞失衡,miR-155与Th17细胞及相关细胞因子呈正相关,与Treg细胞及相关细胞因子呈负相关,miR-155可能通过调节Th17/Treg平衡参与过敏性紫癜发生过程,是治疗过敏性紫癜的新靶点。