刘 军,郑晓芬,周丽娟,周海燕,杨海燕,曹建军

(亚宝药业集团股份有限公司,运城 044600;*通讯作者,E-mail:caojianjun@yabaoyaoye.com)

丁桂儿脐贴为亚宝药业集团股份有限公司的独家品种,由丁香、肉桂、荜茇三味药组成,具有健脾温中,散寒止泻的作用。适用于小儿泄泻、腹痛的辅助治疗[1-3]。丁桂儿脐贴的质量标准中主要是对有效成分丁香酚进行控制来保证产品的质量[4,5],但是中药质量控制的方法只对其中少数已知成分进行分析,无法体现中医药的整体性特点,因此,为了更好地控制中药制剂的质量,必须发展中药质量控制的新方法,建立现代质量控制标准的新体系。中药指纹图谱可以分析中药中有效成分和无效成分的种类和其量分布的信息,符合中医药整体性和模糊性的特点,是中药制剂质量控制的重要手段,可较全面地反映原料药材、制剂工艺全过程及成品的质量,已成为现代中药制剂质控的重要方法[6,7]。本研究通过对丁桂儿脐贴的HPLC指纹控制方法进行探究,旨在建立丁桂儿脐贴的HPLC质量控制新方法,同时为过程控制提供新方法,更全面控制丁桂儿脐贴的产品质量。

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

U3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司),Agilent 1260高效液相色谱仪;XP205电子天平(梅特勒托利多国际股份有限公司),超声波清洗器(KQ-500DE,昆山市超声仪器有限公司)。

丁香酚(批号:110725-201414),桂皮醛(批号:110710-201619),胡椒碱(批号:110775-201405),所有对照品均来源于中国食品药品检定研究院,丁桂儿脐贴(批号:1711503A,151226、1609501A、1701209A、1703201A、1706201A、1709205A、1709510A、1709211B、1709212B、1709212A,1711214A,1711215A),乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司,批号:175157),甲醇(色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司,批号:160728),甲酸(国药集团化学试剂有限公司),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备 取本品,剪碎,混匀。取1 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,称定重量,加热回流1 h,取出,放至室温,再称定重量,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

1.2.2 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 250 mm×4.6 mm,5 μm);检测波长254 nm;柱温30 ℃;流速1.0 ml/min;以甲醇为流动相A,0.2%甲酸溶液为流动相B,梯度洗脱(0-15 min,8%-25%A;15-25 min,25%-40%;25-50 min,40%-70%;50-90 min,70%-90%A),以桂皮醛的色谱峰为S峰,理论板数以桂皮醛峰计应不低于10 000。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 专属性 按处方辅料比例,按制备工艺制成阴性对照制剂,再按供试品溶液制备方法制备成阴性对照液。按1.2.2项下色谱条件分析,记录色谱图。

1.2.3.2 精密度 取丁桂儿脐贴,按1.2.1项下制备方法制备供试品溶液,按1.2.2项下色谱条件进样6次,序号依次为1-6,以6号峰桂皮醛作为参照物,计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

1.2.3.3 重复性 取同一批次丁桂儿脐贴6份,序号依次为1-6,按1.2.1项下制备方法制备供试品溶液,按1.2.2项下色谱条件检测,以6号峰桂皮醛作为参照物,计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

1.2.3.4 稳定性 取丁桂儿脐贴样品,按1.2.1项下制备方法制备供试品溶液,按1.2.2项下色谱条件分别于0,2,4,8,12,18,24,32,40,48 h进样检测,以桂皮醛作为参照物,计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

1.2.3.5 耐用性 使用不同型号的仪器(Agilent 1260、Agilent 1200、岛津LC-20AT)、不同批次(序列号:USCL 060354、USCL 059648、USCL 058060、USCL 036549)的色谱柱对同一批次丁桂儿脐贴进行检测,选用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)计算其相似度。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 结果显示辅料对样品检测无影响,能够保证指纹图谱检测过程中的专属性(见图1)。

2.1.2 精密度试验 结果显示12个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积稳定(见图2,表1,2),RSD均小于3%,表明该仪器的精密度良好。

图1 专属性图谱Figure 1 Specificity of fingerprints

图2 丁桂儿脐贴精密度试验12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积对比图Figure 2 The precision results of relative retention time and peak area of 12 common peaks of Ding Gui Er Qi Tie

表1 丁桂儿脐贴指纹图谱保留时间的精密度结果(min)

Table 1 The results of precision of retention time of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie(min)

峰号第1次第2次第3次第4次第5次第6次RSD(%)10.17750.17730.17690.17750.17670.17720.1920.50310.50290.50230.50270.50190.50250.0930.53940.53900.53860.53880.53830.53860.0840.81450.81360.81400.81410.81390.81340.0550.86170.86150.86160.86180.86170.86120.0361.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.25181.25191.25131.25211.25131.25160.0381.48781.48671.48511.48551.48351.48500.1191.64931.64831.64591.64551.64341.64520.14101.73031.72931.72701.72521.72321.72400.17111.92381.92281.91881.91161.90781.90920.37122.17662.17642.16832.15372.14812.14970.62

2.1.3 重复性试验 结果12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积稳定,RSD均小于1%,表明该方法重复性良好(见表3,4)。

表2 丁桂儿脐贴指纹图谱峰面积的精密度结果

Table 2 The results of precision of peak area of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

峰号第1次第2次第3次第4次第5次第6次RSD(%)10.42360.42400.42770.42820.42980.43000.6620.80040.80240.80390.80550.80860.80730.3930.51620.51820.51950.51950.52140.51470.4840.29660.29220.29380.29400.29580.29670.6252.35612.36562.36862.38972.40132.40160.8361.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0070.59360.58830.59150.59140.59780.59600.5980.64800.64850.65240.65320.65520.65480.4890.10310.10430.10490.10440.10460.10410.60100.07850.07850.07870.07800.07890.07790.50110.20250.21240.21050.20030.20070.19992.73120.17790.17850.17860.17780.17820.17850.20

表3 丁桂儿脐贴指纹图谱相对保留时间的重复性结果(min)

Table 3 The results of repeatability of retention time of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie(min)

峰号1号2号3号4号5号6号RSD(%)10.17750.17760.17770.17720.17700.17700.1820.50310.50330.50290.50270.50270.50270.0630.53940.53950.53910.53900.53880.53890.0640.81400.81380.81370.81380.81370.81390.0250.86170.86150.86150.86140.86140.86160.0261.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.25151.25181.25221.25201.25211.25220.0381.48651.48691.48591.48591.48581.48620.0391.64621.64671.64551.64671.64671.64750.05101.72341.72431.72411.72641.72641.72710.09111.89971.90121.91371.91321.91141.91530.36122.12522.12792.15612.15512.15132.16000.72

表4 丁桂儿脐贴指纹图谱峰面积的重复性结果

Table 4 The results of repeatability of peak area of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

峰号1号2号3号4号5号6号RSD(%)10.43570.44250.44510.42440.44040.46052.6920.80790.82520.82690.79410.82700.85082.3630.51730.52960.52690.51370.52910.54221.9340.29510.30270.30410.29400.30270.30981.9752.39822.41102.46072.37262.48082.39791.7261.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0070.59250.59160.59720.59150.59780.60340.7980.66070.66820.66890.64900.66960.67701.4590.10440.10540.10550.10310.10640.10731.41100.07530.07620.07760.07810.08020.08032.62110.19590.19900.20070.19950.20590.20211.68120.17170.17550.17830.18110.18580.18362.93

2.1.4 稳定性试验 结果显示12个共有峰的相对保留时间稳定,RSD均小于1%,相对峰面积相对恒定,RSD均小于3%(见表5,6);表明本品的供试品溶液至少在48 h内稳定。

表5 丁桂儿脐贴指纹图谱保留时间稳定性结果(min)

Table 5 The results of stability of retention time of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie(min)

峰号0 h2 h4 h8 h12 h18 h24 h32 h40 h48 hRSD(%)10.17740.17640.17720.17610.17640.17520.17600.17610.17860.17580.5520.50250.50040.50290.50050.50050.50030.50070.50150.50130.50030.1930.53870.53670.53940.53660.53670.53680.53710.53760.53740.53660.1940.81390.81330.81570.81510.81460.81410.81420.81460.81480.81410.0950.86170.86120.86450.86310.86250.86160.86180.86220.86270.86220.1161.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.25151.24951.25321.25201.25131.25211.25201.25181.25131.25180.0881.48441.48281.48851.48661.48461.48631.48661.48691.48491.48580.1191.64511.64301.65061.64601.64501.64681.64701.64721.64601.64700.12101.72491.72301.73131.72661.72411.72611.72571.72621.72671.72760.13111.90931.90771.91951.91511.90501.90761.90261.90371.91341.90940.28122.14742.14522.16562.14572.13912.14062.13102.13122.15452.15050.49

表6 丁桂儿脐贴指纹图谱峰面积的稳定性结果

Table 6 The results of stability of peak area of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

峰号0 h2 h4 h8 h12 h18 h24 h32 h40 h48 hRSD(%)10.43510.43830.44190.43850.44000.42460.44570.45070.45030.45361.9620.81750.81210.82170.82460.82760.83500.84180.85000.85130.85191.7830.52750.52920.53930.53600.53720.55150.54860.54600.58260.55772.9740.30020.29740.30700.30330.30490.30060.30450.30820.31190.30891.4752.41432.41902.43482.45342.45022.45982.46432.49222.52372.50991.4961.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0070.59030.58930.60550.59510.59090.59490.59660.60350.60050.60100.9680.66270.66340.66900.66600.66740.67130.67230.68070.68410.68251.1890.10520.10550.10940.10630.10640.11040.11090.11180.11260.11182.65100.07880.07880.07960.08060.07940.07910.07890.07990.08210.08141.45110.20150.20200.20410.20340.20270.20400.20360.20620.21220.20431.49120.18170.18150.18400.18180.18150.18290.18400.18580.18750.18691.25

2.1.5 耐用性研究 不同型号仪器间测定结果大致相同,指纹图谱相似度均大于0.98,说明高效液相色谱仪的型号对本指纹图谱方法影响不大,仪器耐用性良好。

按拟定的指纹图谱测定方法,使用不同批次色谱柱对同一批次丁桂儿脐贴进行检测,以其中任一批次色谱柱图谱为参照,计算相似度,结果表明不同批次色谱柱间测定结果大致相同,指纹图谱相似度均大于0.99,色谱柱耐用性良好(见表7)。

2.2 指纹图谱建立

2.2.1 丁桂儿脐贴对照图谱建立 对亚宝药业集团股份有限公司生产的批号为151226、1609501A、1701209A、1703201A、1706201A、1709205A、1709510A、1709211B、1709212B、1709212A的丁桂儿脐贴,共计10批次样品,分别按上述建立的指纹图谱测定方法进行检测,采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版本)拟合生成对照指纹图谱,对照峰为桂皮醛色谱峰(见图3)。

表7 丁桂儿脐贴指纹图谱耐用性结果

Table 7 The results of robustness of fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

条件 相似度仪器型号 Agilent 12601.000 Agilent 12000.999 岛津LC-20AT0.987色谱柱序列号 USCL 0603541.000 USCL 0596480.997 USCL 0580600.998 USCL 0365490.999

6号峰为对照峰;其余色谱峰未进行结构确定图3 丁桂儿脐贴对照指纹图谱Figure 3 Control fingerprints of Ding Gui Er Qi Tie

2.2.2 丁桂儿脐贴指纹图谱相似度评价 采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版本)对比亚宝药业集团股份有限公司生产的批号为1711214A、1711215A、1711503A的丁桂儿脐贴指纹图谱相似度,结果显示，3批丁桂儿脐贴相似度与对照指纹图谱比较均>0.990(见表8,图4)。

表8 丁桂儿脐贴3批次指纹图谱检测结果

Table 8 Similarity evaluation of chromatogram of 3 batches of Ding Gui Er Qi Tie samples

样品批号相似度丁桂儿脐贴1711214A0.9911711215A0.9901711503A0.990

3 讨论

2000年国家药品监督管理部门首先提出建立中药注射剂指纹图谱及相关质控要求,在注射剂指纹图谱基础上,已逐步开展对中药材、半成品、成品制剂的指纹图谱研究[8-10]。中药制剂由多味中药加工而成,化学成分复杂,其疗效非任何一个活性成分可代表,亦不是多个化学成分药用作用的简单相加,指纹图谱技术可对中药制剂进行整体性评价,对制剂质量控制具针对性和合理性[11,12]。

丁桂儿脐贴为亚宝药业集团股份有限公司的独家品种,虽然对进厂药材和中间过程进行了很好的控制,包括了全自动的提取和制剂生产过程,但是近年来药材本身带来的差异对产品质量产生很大的影响,为了更好地控制产品质量,本研究通过对供试品制备和色谱条件的方法学考察及方法学验证,建立了丁桂儿脐贴的HPLC指纹图谱测定方法,为其质量评价提供了新的方法。本研究的局限性在于仅对丁桂儿脐贴制剂的HPLC方法进行了考察,未对生产过程的变化情况进行分析,因此后续的研究还需关注药材-中间过程-制剂的指纹图谱的变化情况。

图4 不同批号的指纹图谱检测结果Figure 4 Similarities fingerprints of different batch number