王永瑞,孔 丽,王文娟,李宸宇,周国宏*

(1山西医科大学第一临床医学院眼科,太原 030001;2山西医科大学解剖教研室;3山西省眼科医院泪道病科;*通讯作者,E-mail:guohongzhou2005@163.com)

视网膜新生血管性疾病是严重的致盲性眼病,以视网膜表面出现大量新生血管为其特征,发病机制极其复杂,可能与多种细胞因子及信号传导通路有关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前公认的最重要的血管生成促进因子。Cathepsin B是一种半胱氨酸组织蛋白酶,普遍存在于人体各组织[1],在视网膜新生血管形成中与VEGF存在一定的相关性,抑制Cathepsin B能下调VEGF的表达[2]。JAK2/STAT3信号通路在生物体内发挥重要作用,可激活VEGF[3],抑制JAK2/STAT3能抑制VEGF的表达[4]。因此,我们推测抑制Cathepsin B可能通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制VEGF的表达,从而抑制视网膜新生血管形成。本研究将Cathepsin B的抑制剂CA-074 Me作用于小鼠氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型,研究视网膜新生血管形成过程中CA-074 Me对JAK2/STAT3信号通路的影响,进一步揭示视网膜新生血管形成的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

7日龄C57BL/6J小鼠44只,雌雄不限,清洁级,体质量4.0-5.0 g。动物房照射12 h/黑暗12 h,温度(22±2)℃,相对湿度50%-60%。实验严格依照由国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》进行。将小鼠随机分为正常对照组(11只22眼)和高氧处理组(33只66眼)。正常对照组小鼠在自然环境中与母鼠共同喂养;高氧处理组小鼠参照改良Smith法建立OIR模型[5],与母鼠共同置于氧体积分数为(75±2)%的密闭氧箱内喂养5 d。12日龄小鼠造模成功后出氧箱,随机分为模型组、实验对照组和实验组,每组均有11只22眼(n=22)。实验对照组和实验组小鼠腹腔内注射5%水合氯醛(0.1 ml/10 g体质量)麻醉[6],麻醉妥后,散双瞳,微量注射器从角膜缘后1 mm垂直进针刺入玻璃体腔,分别给予DMSO和CA-074 Me(溶于DMSO溶剂中,100 mg/L)1 μl。正常对照组和模型组的小鼠不予任何药物干预。继而所有小鼠均在自然环境中喂养5 d直至17日龄。

1.2 主要试剂及仪器

CA-074 Me(美国Biomol公司);EZNATMTotal RNA Kit I(美国Omega公司);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(上海生工生物科技有限公司);RNA裂解酶(美国Sigma公司);兔抗鼠JAK2抗体、兔抗鼠STAT3抗体、HRP标记羊抗兔IgG二抗、HRP标记羊抗鼠IgG二抗,β-actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。氧箱(青岛科凯电子研究所有限公司);解剖显微镜(苏州六六有限公司);荧光显微镜(德国Leica公司);多功能数字凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 视网膜铺片观察新生血管

从每组的17日龄小鼠中随机各取2只,参照文献[2]描述的方法,水合氯醛全身麻醉后,取异硫氰酸葡聚糖荧光素(FITC-dextran,相对分子质量为2×106)50 mg,溶于1 ml质量分数为4%的多聚甲醛溶液,行小鼠左心室灌注。灌注后立即摘除小鼠双侧眼球,置于4%中性缓冲甲醛固定液中浸泡固定3 h,解剖显微镜下去除角膜、晶状体及玻璃体后,将视网膜组织完整剥离,以视乳头为中心做4个放射状切开,将视网膜平铺于载玻片上,滴少量生理盐水,加盖玻片,立即置于荧光显微镜下观察、拍照并保存图片。

1.4 real-time PCR法检测视网膜内JAK2和STAT3 mRNA

从每组的17日龄小鼠中随机各取4只,经颈椎脱臼法处死后,取双侧眼球,获取视网膜。按EZNATMTotal RNA Kit I试剂盒说明书提取视网膜总RNA,按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板,分别PCR扩增JAK2和STAT3基因。应用Primer 3软件设计PCR引物,JAK2基因上游引物:5′-TCTGTGGGAGATCTGCAGTG-3′,下游引物:5′-TTTCAGAGCTGTCATCCGTG-3′;STAT3基因上游引物:5′-GACCCGCCAACAAATTAAGA-3′,下游引物:5′-TGGTGTCCAGTTTACCACGA-3′;β-actin上游引物:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′,下游引物:5′-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3′。PCR条件:94 ℃预变性10 min,94 ℃变性15 s,60 ℃退火和延伸60 s,共45个循环。反应结束后提取real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线数据。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法[7]计算β-actin、JAK2和STAT3 mRNA的相对表达量。

1.5 Western blot法检测视网膜内JAK2和STAT3蛋白

每组剩余的5只17日龄小鼠经颈椎脱臼法处死,取双侧眼球,获取视网膜,用裂解液裂解。参照文献[2]描述的方法,每组视网膜组织分别置于1.5 ml Eppendorf管中,95 ℃作用5 min,迅速冰浴,4 ℃,10 000 r/min离心10 min,收集上清;SDS-PAGE(5%的浓缩胶,8%的分离胶:JAK2,15%的分离胶:STAT3、β-actin)分离蛋白样本;电转印法将电泳条带转印到PVDF膜上,5%牛血清白蛋白溶液4 ℃封闭过夜;分别加入兔抗鼠JAK2单克隆抗体或兔抗鼠STAT3单克隆抗体,4 ℃孵育过夜,洗涤,加入抗兔IgG二抗,孵育,洗涤;ECL底物化学发光,显影,定影,扫描。以β-actin为内参。根据各组组织中β-actin、JAK2和STAT3蛋白印迹测定的光密度值,以JAK2/β-actin和STAT3/β-actin的比值表示各组中JAK2和STAT3蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 荧光显微镜下各组小鼠视网膜新生血管形态比较

如图1所示,荧光显微镜下可清晰地显示小鼠视网膜主要小血管和毛细血管的形态,正常对照组视网膜血管形态清晰,走行清楚,无新生血管簇、血管渗漏,无缺血无灌注区;模型组和实验对照组视网膜血管走行迂曲,较多新生血管簇和视网膜缺血无灌注区;实验组视网膜血管走行相对清晰,未见明显的缺血无灌注区。

A.正常对照组 B.模型组 C.实验对照组 D.实验组图1 荧光显微镜下各组小鼠视网膜新生血管形态比较 (FITC-dextran,×50)Figure 1 Morphological changes of retinal neovascularization in each group under fluorescence microscope (FITC-dextran,×50)

2.2 小鼠视网膜中JAK2和STAT3 mRNA相对表达量比较

各组视网膜中JAK2和STAT3 mRNA相对表达量总体比较,差异有统计学意义(JAK2:F=24.86,P<0.001;STAT3:F=24.22,P<0.001)。与正常对照组相比,模型组和实验对照组中JAK2和STAT3 mRNA的表达量显著增高(P<0.05);与模型组和实验对照组相比,实验组中JAK2和STAT3 mRNA的表达量显著降低(P<0.05);实验组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);实验对照组与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 四组视网膜JAK2和STAT3 mRNA表达量的比较(2-ΔΔCt)

Table 1 Comparison of JAK2 and STAT3 mRNA expression level in retinas among four groups(2-ΔΔCt)

组别nJAK2STAT3正常对照组80.12±0.040.05±0.02模型组83.79±1.66∗1.94±0.87∗实验对照组82.61±1.02∗1.15±0.58∗实验组80.54±0.30#0.12±0.07# F24.8624.22 P<0.001<0.001

与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组和实验对照组比较,#P<0.05

2.3 小鼠视网膜中JAK2和STAT3蛋白相对表达量比较

四组视网膜中JAK2和STAT3蛋白表达量总体比较,差异有统计学意义(JAK2:F=53.90,P<0.001;STAT3:F=35.87,P<0.001)。与正常对照组相比,模型组和实验对照组中JAK2和STAT3蛋白的表达量显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组和实验对照组相比,实验组中JAK2和STAT3蛋白的表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);实验组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);实验对照组与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见图2、表2)。

表2 视网膜JAK2和STAT3蛋白表达量比较

Table 2 Comparison of JAK2 and STAT3 protein expression level in retinas among four groups

组别nJAK2STAT3正常对照组100.38±0.150.32±0.11模型组101.01±0.09∗1.02±0.04∗实验对照组100.94±0.09∗1.05±0.04∗实验组100.41±0.11#0.50±0.28# F53.9035.87 P<0.001<0.001

与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组和实验对照组比较,#P<0.05

3 讨论

视网膜新生血管是一种病理性的血管,是多种缺血、缺氧性视网膜疾病发展到终末阶段的特征性表现,如增殖性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变和缺血型视网膜静脉阻塞等[8,9]。视网膜新生血管发育不成熟,新生血管的基底膜不完整甚至缺失,血管内的大分子物质就会漏出至组织间隙,表现为玻璃体积血、黄斑水肿、牵拉性视网膜脱离等改变,视力发生不可逆的损伤,严重威胁着各个年龄阶段人群的视力健康。

视网膜形成新生血管的机制极其复杂,涉及多种细胞因子及复杂信号通路的作用。视网膜处于缺血、缺氧等条件时,血管系统内的各细胞因子之间的动态平衡失调,表现为以VEGF为主的血管生成促进因子大幅度的增加等[10-12]。JAK2/STAT3通路是细胞内信号通路,介导多种因子的信号传导,被VEGF等细胞因子激活后,可进入到细胞核中,调控细胞增殖分化和新生血管形成等过程[13,14]。STAT3的异常活化,可调控STAT3/VEGF信号通路,调控VEGF的表达[15,16];抑制JAK2/STAT3通路,则可下调VEGF[17]。Cathepsin B是一种半胱氨酸组织蛋白酶,参与体内多种蛋白的水解,维持着细胞内的平衡。缺血、缺氧等病理条件下,视网膜上分布的Cathepsin B和视网膜新生血管形成密切相关,Cathepsin B和VEGF之间存在双向调节机制,抑制Cathepsin B可以抑制VEGF的表达[2]。因此,我们推测抑制Cathepsin B可能通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制VEGF的表达,从而抑制视网膜新生血管形成。

CA-074 Me是Cathepsin B的特异性抑制剂,能抑制视网膜新生血管中Cathepsin B的表达[18,19]。在本研究中,我们首先建立了小鼠OIR模型,于第17天时,小鼠视网膜表面均出现了大量新生血管,由此证实了小鼠从封闭的高氧环境中进入到正常环境后,相对缺氧会诱导视网膜新生血管形成。然后我们将CA-074 Me作用于小鼠玻璃体腔,检测视网膜组织中JAK2和STAT3的表达情况,研究抑制Cathepsin B对JAK2/STAT3信号通路的影响。我们得到的结果是:视网膜新生血管形成以后,JAK2和STAT3在视网膜组织中均过度表达;而给予CA-074 Me之后,JAK2和STAT3在视网膜组织中的表达均受到了抑制。

综合考虑以上分析,这些结果提示小鼠从封闭的高氧环境中进入到正常环境后,视网膜组织中的JAK2和STAT3蛋白会大量释放并激活JAK2/STAT3信号通路,CA-074 Me可下调JAK2/STAT3信号通路。这一机制可能是CA-074 Me抑制Cathepsin B以后,通过Cathepsin B对JAK2/STAT3信号通路的作用实现的;也可能是CA-074 Me对JAK2/STAT3信号通路的直接作用,需要我们在今后的实验中进一步证实。此外,本次实验我们只选取了44只小鼠,每组仅有11只,样本量相对较小,所得结果可能有一定的局限性。相信随着视网膜新生血管领域研究的深入,有望给视网膜新生血管性疾病的诊疗提供新的思路和方法。