许小斌,武伟男,马 宁,连世忠*

(1山西医科大学第一临床医学院神经外科,太原 030001;2山西医科大学第一医院神经外科;*通讯作者,E-mail:13934236496@163.com)

microRNA属于一种非编码RNA分子,它的序列非常短小,过去,人们一直认为microRNA是没有任何生物学功能的无用基因,但随着研究的深入,人们发现,它虽然没有编码蛋白质的功能,却扮演着调控mRNA分子的重要角色。microRNA通过与mRNA序列特异性结合、抑制或促进mRNA的翻译,参与mRNA的降解过程,从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和周期等细胞活性。miRNA-147属于microRNA大家族中的一员,过表达miRNA-147可明显抑制肺腺癌细胞A549的增殖能力和侵袭能力[1],miRNA-147可以作用于EGFR驱动的细胞周期网络蛋白,抑制乳腺癌细胞的细胞周期[2],miRNA-147还可以通过调控Akt/mTOR信号通路,产生抑制乳腺癌细胞增殖和迁移的作用[3]。由上可知,miRNA-147在肿瘤中发挥着抑癌基因的作用,过表达miRNA-147可以抑制肿瘤细胞的增殖能力、迁移能力和细胞周期等细胞活性,因此我们推断,过表达miRNA-147也可能会对胶质瘤细胞产生类似的作用,本实验通过转染技术提高了胶质瘤U87细胞中miRNA-147的表达量,并进一步验证了miRNA-147高表达是否会影响U87细胞的增殖、周期和迁移。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和试剂

U87细胞为本实验室保存细胞株。SYBR Green PCR试剂盒购自KAPA Biosystems公司,DMEM购自Hyclone公司,胎牛血清购自Gibco公司,Cycletest Plus DNA Reagent Ki和碘化丙啶均购自BD公司,CCK-8购自Bioswamp公司,0.25%胰蛋白酶购自Bioswamp公司,逆转录试剂盒购自TaKaRa公司等。

1.2 培养和转染细胞

培养基基本成分:DMEM、FBS;培养环境:5%CO2、37 ℃恒温培养箱。根据Lipofectamine2000转染试剂盒的说明书流程进行瞬时转染,分别将阴性对照和miR-147模拟物转染进入胶质瘤细胞系U87中,并分成两组:阴性对照组和miR-147模拟物组。转染48 h时,通过实时荧光定量PCR技术分别检测对照组和模拟物组细胞中miR-147的表达量。

1.3 利用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中miRNA-147的表达

通过实时荧光定量PCR扩增来判断转染前后miR-147表达差异。首先通过Trizol试剂提取出总RNA,然后在反转录试剂引导下进行RNA的反转录获得cDNA第一链,最后以单链cDNA为PCR模板,在对应引物的引导下,以U6为内参,进行miR-147水平的实时荧光定量PCR检测。引物如下:miR-147-F:GGGGTGTGTGGAAAT,miR-147-R:AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC;U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,U6-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。反应程序:95 ℃,3 min;95 ℃ 5 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 25 s,39 cycles;65 ℃ 5 s,95 ℃ 50 s。miR-147的表达水平采用Ct值比较法进行计算。

1.4 CCK-8法检测各组细胞增殖能力

收集生长良好的对数期U87细胞,分于96孔板中,调整到适宜的细胞密度,每个时间点均设置3个复孔,培养至胶质瘤细胞贴壁生长并转染细胞。分别于0,24,48,72 h向各组培养孔中加入适量CCK8溶液,继续培养4 h,最后检测450 nm处各个孔相应的OD值。

1.5 流式分析仪分析各组细胞的细胞周期

用0.25%胰酶消化各组细胞,吹打使其充分变匀,制备成单细胞悬液离心,收集到流式专用管中,离心并去上清,PBS(其中含有FBS)进行重悬,移入离心管内,加入无水乙醇,在-20 ℃温度下固定24 h以上;细胞固定好以后,进行离心,去掉上清液,使用PBS洗涤沉淀若干次,用1 mg/ml的RNase A溶液消化细胞内的RNA;用PI溶液避光环境下染核10 min;最后用流式细胞仪分析两组细胞细胞周期百分比。

1.6 划痕实验检测各组细胞迁移能力

首先在6孔培养板背面均匀地画出多条粗细均匀、距离相等的平行线,孔中加入细胞,待细胞铺满培养孔,用无菌移液头在细胞中划出划痕,划痕要求粗细均匀且垂直于平行线,缓慢冲洗散落的细胞,继续无血清培养。以平行线与划痕的交点作为观察点,在0,24,48 h分别定点拍照记录,观察迁移的变化,软件分析48 h时两组细胞平均迁移距离的差异。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 转染miR-147模拟物对miR-147表达影响

通过Lipofectamine2000转染法转染U87细胞,转染48 h时,分别取模拟物组和对照组两组细胞,使用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞的miRNA-147表达量,结果显示:模拟物组miRNA-147相对表达量(11.26±5.73)明显高于对照组(1.03±0.24),差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 转染miR-147模拟物对细胞增殖能力的影响

U87细胞转染模拟物后,CCK-8实验结果显示:在24 h时,模拟物组与对照组的OD值比较,差异无统计学意义(P>0.05);而48,72 h检测结果显示模拟物组OD值(0.33±0.04和0.48±0.06)均明显低于对照组(0.53±0.03和0.87±0.08),差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 转染miR-147模拟物对细胞周期的影响

U87细胞转染模拟物后,溴化丙锭(PI)对细胞染色后,使用流式细胞分析仪分析细胞中的DNA含量,得到了流式周期图(见图1),统计结果显示:模拟物组处于G0/G1期、S期的细胞数比率小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而处于G2/M期的细胞比率明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。

图1 对照组和模拟物组U87细胞周期分布图Figure 1 Distribution of U87 cell cycle in control group and mimics group

与阴性对照组比较，*P<0.05,**P<0.01图2 对照组和模拟物组U87细胞周期分布差异比较Figure 2 Comparison of U87 cell cycle distribution between control group and mimics group

2.4 转染miR-147模拟物对细胞迁移能力的影响

U87细胞转染模拟物后,分别于0,24,48 h进行拍照记录,分析48 h时的细胞迁移平均距离,对照组平均迁移距离为(186.52±21.26)μm,而miRNA-147模拟物组平均迁移距离为(106.63±18.06)μm,模拟物组迁移距离明显小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

3 讨论

胶质瘤瘤细胞非常容易转移到远离原发灶的脑组织中,试图通过手术彻底切除扩散的肿瘤组织,其可能性微乎其微;浸润生长、复发、放化疗耐受是胶质瘤导致患者死亡的主要因素;虽然针对胶质瘤治疗的研究越来越深入,但到目前为止,还是没能寻找到明显提高胶质瘤生存率的治疗手段,所以它的病死率仍居高不下[4,5]。近年来神经胶质瘤在外科和医学影像技术以及放疗、电场治疗、化疗和免疫疗法等多个领域都取得了令人瞩目的成果,但胶质瘤细胞十分容易在正常脑实质内广泛传播的本质特性还是严重限制了其治疗的效果[6-8]。microRNA可以刺激某些靶基因的活化,也可以沉默某些基因,借此调控疾病的发生与发展[9]。已有大量研究证明,microRNA与对应靶基因之间存在相互调控,这种调控存在着一种平衡,平衡一旦被打破,很可能导致肿瘤的发生[10]。microRNA参与了肿瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡、分化、生长、侵袭、迁移以及血管新生等各个环节,对肿瘤细胞的生物活性有很大的调控作用,研究microRNA与肿瘤细胞生物活性的关系,可以为肿瘤的研究指明新的方向,有利于肿瘤的早期发现和早期治疗[11]。

图3 对照组和模拟物组U87细胞迁移距离 (×100)Figure 3 Migration distance of U87 cells in control group and mimics group (×100)

miRNA-147属于microRNA大家族中的重要一员,miR-147在大肠癌组织中表达下调,MAFG-AS1在大肠癌组织中的表达上调,MAFG-AS1过表达可促进细胞增殖、加快细胞周期进程,并抑制细胞凋亡,而miR-147的转导可以部分逆转MAFG-AS1对细胞过程的影响[12];柳家荣等[13]通过细胞实验发现,miRNA-147过表达可抑制Skov3细胞的增殖并诱导其凋亡;HOXD-AS1基因敲除可抑制NSCLC细胞增殖,促进其凋亡,Wang等[14]研究发现,抑制miRNA-147可阻断HOXD-AS1基因敲除对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响;在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,miRNA-147可通过调控Akt/mTOR信号通路,产生抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用[3]。

综上所述,我们发现miRNA-147可以抑制多种癌细胞的细胞活性。为了证明miRNA-147是否会抑制胶质瘤U87细胞的增殖能力、迁移能力和细胞周期,本实验首先将miRNA-147模拟物转染进入U87细胞中,并通过实时荧光定量PCR技术检测了转染后的miRNA-147表达水平,结果显示模拟物组细胞中miRNA-147的表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义。在此基础上研究了miRNA-147高表达对U87细胞增殖、细胞迁移和细胞周期的影响,实验结果显示,细胞转染48,72 h时,模拟物组光密度值均明显低于对照组,差异有统计学意义,说明miRNA-147可以抑制U87细胞的增殖能力;细胞转染48 h时,模拟物组处于G2/M期的细胞比例明显高于对照组,差异有统计学意义,说明miRNA-147可以阻滞U87细胞于G2/M期,结合前面的增殖检测结果,我们推测,miRNA-147可能是通过阻滞U87细胞的细胞周期,影响其进行正常的有丝分裂,进而降低了胶质瘤细胞的增殖能力;细胞转染48 h时,模拟物组细胞迁移距离明显小于对照组,说明miRNA-147可以抑制U87细胞的迁移能力。但是,miRNA-147是通过何种机制对U87细胞产生作用的,它的作用靶基因是什么,仍需要进一步实验验证。

综上所述,miRNA-147可以抑制U87细胞的增殖能力、迁移能力,并阻滞U87细胞于G2/M期,影响其进行正常的有丝分裂,miRNA-147可能在胶质瘤中发挥抑癌基因的作用,这为神经外科诊断和治疗胶质瘤提供了新的标记物。