于 洋,王 力,窦 晶

(大连市第五人民医院呼吸科,大连 116000;*通讯作者,E-mail:2910938486@qq.com)

哮喘的特征是可逆性气流阻塞、气道高反应性(airway hyperresponsiveness,AHR)、气道炎症、气道重塑、黏液分泌亢进和气道上皮下纤维化[1-3]。哮喘发病机制的一个重要环节是气道重塑引发的损伤,即上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[4,5]。EMT指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。EMT降低了气道上皮细胞进行药物治疗的灵敏度,从而减少了糖皮质激素治疗重症哮喘糖尿病患者的疗效。转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是参与介导气道重塑的重要细胞因子[6-8]。TGF-β诱导的EMT由NF-κB依赖性细胞信号传导[9-11]。NF-κB信号通路的IKKβ的抑制剂BMS-345541[(2′-氨基乙基)氨基-1,8-二甲基咪唑并(1,2-a)喹喔啉]具有100%口服生物利用度和2.2 h的静脉半衰期,故该药适合用于研究IKKβ抑制剂在疾病模型中的应用[12,13]。核因子抑制剂IKKβ可以弱化由促炎细胞因子和TLR3受体激动剂所引起的上皮细胞合成能力的激活,故核因子抑制剂IKKβ可能为支气管哮喘的治疗提供一个重要的新方法[14]。故本研究通过对不同模型小鼠(对照组、哮喘模型组、BMS组)血清和BALF中的TGF-β1浓度、E-钙黏蛋白和波形蛋白mRNA的转录水平、EMT调节剂E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达水平等指标的分析,探索BMS-345541对哮喘小鼠气道重塑和气道上皮间质转化的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J 6-7周龄小鼠48只,体质量(18±2)g,购自北京斯贝福生物技术有限公司,由大连中心医院动物实验中心自养21 d。屏障系统动物房,温度(25±2)℃,相对湿度50%-60%,每天12 h(8:00-20:00)照明。动物实验的操作与处理由大连中心医院动物实验中心动物保健与使用委员会批准,遵循实验动物伦理要求。

1.2 主要试剂与仪器

BMS-345541(美国sigma试剂公司);OVA(美国sigma试剂公司);氢氧化铝(上海碧云天公司);小动物呼吸机(瑞沃德动物实验仪器公司);E-钙黏蛋白和波形蛋白mRNA试剂盒(上海碧云天公司)。

1.3 小鼠哮喘模型建立

使用卵清蛋白(OVA)在气道重塑和气道上皮间质转化(EMT)中建立小鼠哮喘模型,SPF级C57BL/6小鼠48只随机分为3组,包括对照组(n=16,不做任何处置)、哮喘模型组(n=16)、BMS组(n=16,哮喘模型同时腹腔注射BMS-345541)。

1.4 小鼠哮喘症状严重程度和气道反应性的测定

对所有小鼠称重,小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉,完全暴露颈部气管,通过气管切开术插入气管导管(内径2 mm),将气管导管连接到小动物呼吸机装置,机械通气,潮气量为0.2 ml,频率为140次/min。在呼吸机、PBS和一系列增加剂量作用下平衡5 min,小鼠腹腔注射不同浓度的(3,6,12 mg/ml)乙酰胆碱(acetylcholine,ACH)后,通过传感器收集小鼠表现出的多样性哮喘症状并加以评估。另将小鼠注射OVA,15 min后,测量肺阻力(RL)以评估AHR的变化。

1.5 ELISA法测定血清和BALF中的TGF-β1浓度

造模干预后第2周,通过尾静脉采集外周血0.5 ml,用TGF-β1 ELISA试剂盒测量血清和BALF中的TGF-β1的浓度。微孔板检测光学密度(OD),通过OD值确定TGF-β1水平。

1.6 肺组织病理学

石蜡包埋的部分用苏木精和伊红(H&E)染色观察气道重塑的变化,进行高碘酸-希夫(PAS)染色。染色步骤:切片脱蜡至水;高碘酸液处理5-10 min;流水冲洗5 min,擦干切片上多余水分;滴加Schiff染液,染色10-15 min;流水清洗5-10 min;Mayer苏木素复染;分化、水洗;返蓝、水洗;常规脱水,二甲苯透明;中性树胶封片;显微镜观察结果:糖原、中性黏液物质呈红色,细胞核呈蓝色,使用尼康dS-Ri2数码相机进行拍摄图像。

1.7 实时荧光定量PCR法测定E-钙黏蛋白和波形蛋白mRNA水平

取肺组织,匀浆后采用Trizol法提取细胞总RNA,分别在280 nm波长和260 nm波长测定吸光度,计算RNA原液浓度和OD260/OD280。根据RNA原液浓度以及试剂盒说明调整RNA浓度,使RNA稀释液浓度为500 ng/μl。按E-钙黏蛋白和波形蛋白mRNA试剂盒要求配制反应体系,反应条件为:37 ℃孵育15 min;于85 ℃加热5 s以终止反应,合成的cDNA保存于-20 ℃。RT-PCR反应体系包括：Forward Primer(5 μmol/L)1 μl、Reverse Primer(5 μmol/L)1 μl、2×GoldStar Best MasterMix10 μl、Template DNA 1 μl、RNase-Free Water 7 μl。PCR条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 40 s，分别采用上述5个Tm温度退火30 s，72 ℃延伸3 min，10个循环；退火温度和时间不变，延伸时间每循环递增30 s，20个循环。根据第一次反应结果重新调整Tm值区间，在64-72 ℃之间设置6个温度的Tm值，分别为64,66.3,67.5,68.8,70,72 ℃，筛选最佳反应温度再进行PCR反应。定量分析细胞中E-钙黏蛋白和波形蛋白mRNA含量。引物序列(5′-3′)：TGF-β1上游引物CCAGTCGAACTGACTAGCGCA，下游引物GCCAGCTCGTGACGCGTCAGC；GADPH上游引物CGCGACGCACCATCGCACGAG，下游引物GACGCAGATCACTCAGTGCCAG。严格按照试剂盒说明书进行操作。实时荧光定量PCR引物序列结果以2-ΔΔCt表示。计算公式如下：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.8 蛋白质印迹分析E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达

使用RIPA从肺组织中提取总蛋白裂解缓冲液。使用BCA蛋白质测定试剂盒对蛋白质浓度进行测定,15% SDS-PAGE(50 μg/泳道)分离蛋白并转移到PVDF膜上。含5%非脂肪牛奶在室温下放置1 h,然后在4 ℃过夜孵育抗E-cadherin(1 ∶1 000)和抗vimentin(1 ∶1 000)的抗体、β-肌动蛋白抗体(1 ∶2 000),用HRP偶联的二级探针探测膜抗体(1 ∶3 000)在室温下孵育2 h,用ECL试剂显示。使用Image6.0软件半定量分析E-钙黏蛋白和波形蛋白的相对表达水平。

1.9 统计学分析

本研究采用SPSS20.0统计软件(美国IBM公司);计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析,两两比较采用LSD-t检验;计数资料采用百分率(%)表示,组间比较采用χ2分析;P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMS-345541对OVA诱导的症状的影响

哮喘模型组小鼠表现出多样性哮喘症状,包括烦躁不安,呼吸短促和不规则呼吸节律,咳嗽,抓鼻子,抓耳,萎缩,前肢抬起,活动减少。使用BMS-345541干预后BMS组小鼠哮喘症状减轻。对照组小鼠未表现出哮喘发作或过敏症状。

2.2 BMS-345541对肺阻力的影响

与对照组相比,哮喘模型组和BMS组肺阻力呈上升趋势,且随着药物剂量的增大而增大。随着BMS组中BMS-345541的加入,肺阻力逐渐有所缓解(P<0.05,见表1),且与作用剂量成正比。

表1 BMS-345541对肺阻力的影响cmH2O/(ml·s)

Table 1 Effects of BMS-345541 on pulmonary resistancecmH2O/(ml·s)

组别n3 mg/ml6 mg/ml12 mg/ml对照组162.35±0.472.87±0.313.22±0.73哮喘模型组163.71±0.34a7.64±0.53a13.08±1.03aBMS组162.92±0.51ab3.68±0.94ab6.57±0.73ab F13.32910.29720.771 P0.0010.0010.001

与对照组比较,aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05

2.3 BMS-345541对气道重塑的影响

PAS染色用于评估细胞增生和黏液产生对气道重塑的影响,结果见图1。与对照组相比,哮喘模型组小鼠气道重塑与对照组相比,基底膜增大增厚,杯状细胞增生,黏液分泌过多,上皮损伤增加(见图1B)。使用BMS-345541处理后,基底膜厚度减小,杯状细胞增生减少,黏液分泌量减少,上皮损伤程度减小,嗜酸性粒细胞百分比下降(见图1C)。

图1 BMS-345541对气道重塑的影响 (×100)Figure 1 Effects of BMS-345541 on airway remodeling (×100)

2.4 BMS-345541对血清和BALF中TGF-β1浓度的影响

与对照组相比,哮喘模型组和BMS组的蛋白表达水平升高,血清和BALF中TGF-β1浓度增加。随着BMS-345541的加入,BMS组与哮喘模型组相比,TGF-β1浓度呈现下降趋势(P<0.05,见表2)。

Western blot结果显示,肺组织中TGF-β1表达哮喘组较对照组高，BMS组较哮喘模型组低(见图2)。肺组织中的TGF-β1表达对照组为(952.76±852.06)pg/ml，哮喘模型组为(1 523.85±138.96)pg/ml，BMS组为(1 099.62±105.35)pg/ml;三组间比较差异有统计学意义(F=36.922,P=0.001)。

2.5 实时荧光定量PCR法测定各组小鼠肺组织mRNA相关基因表达情况

与对照组比较,哮喘模型组和BMS组小鼠细胞中TGF-β1基因的mRNA转录水平增加(P<0.05)。

表2 BMS-345541对血清和BALF中的TGF-β1浓度的影响(pg/ml)

Table 2 Effect of BMS-345541 on serum and BALF levels of TGF beta 1(pg/ml)

组别n血清BALF对照组1631.58±13.4221.94±12.11哮喘模型组1684.37±36.28a45.37±11.96aBMS组1646.04±26.83ab27.41±16.35ab F26.30725.787 P0.0010.001

与对照组比较,aP<0.05;与哮喘模型组比较,bP<0.05

图2 Western blot检测BMS-345541对肺组织中TGF-β1蛋白表达水平的影响Figure 2 Effect of BMS-345541 on the expression of TGF beta 1 protein in lung tissues by Western blot

与哮喘模型组相比,BMS组小鼠细胞中由于BMS-345541的加入,基因表达被抑制,下调较为显著(见图3)。对小鼠组织提取RNA,并使用转录酶试剂盒(Invitrogen)将SuperScript Ⅱ Reverse逆转录为cDNA,包含外显子4-8的381 bp cDNA片段的PCR。结果显示，小鼠肺组织中TGF-β1 mRNA基因转录水平对照组为0.67±0.08,哮喘模型组为0.97±0.11,BMS组为0.82±0.08;三组间比较差异有统计学意义(F=17.309,P=0.001)。

图3 RT-PCR检测基因mRNA转录水平Figure 3 Detection of gene transcription by RT-PCR

3 讨论

哮喘是一种慢性炎症性疾病,哮喘的易感因素和发病机制较为复杂。本研究使用OVA建立小鼠哮喘模型,对BMS-345541抑制OVA诱导的哮喘小鼠进行治疗观察,研究哮喘小鼠气道重塑和气道上皮间质转化的机制。EMT异常是哮喘病理生理学的核心原因[15,16]。EMT的变现包括E-cadherin表达下降,波形蛋白的表达增加以及从上皮细胞到间充质细胞的转变[17-19]。本研究证实BMS-345541具有有效的抗哮喘作用。

与对照组相比，哮喘模型组小鼠嗜酸性粒细胞数量增加，肺组织表现出气道重塑，包括气道平滑肌基底部扩大，膜增厚，上皮损伤，纤维化，杯状细胞增生和黏液分泌过多，这表明气道重塑成功地在OVA诱导的小鼠模型中被建立。哮喘慢性炎症引起的TG-Fβ1分泌增加可能导致EMT，这是气道炎症和气道重塑中最重要的机制。E-钙黏蛋白和波形蛋白是EMT的关键生物标志物。E-钙黏蛋白的丧失可破坏支气管上皮屏障功能，导致支气管上皮失去其结构稳定性和极性。本研究发现，OVA哮喘模型组中E-钙黏蛋白表达下调和波形蛋白表达上调，这些结果证实TGF-β1诱导的EMT在气道重塑中发挥作用。本研究结果还显示OVA诱导哮喘小鼠存在明显的EMT相关的气道重塑，BMS-345541能抑制小鼠哮喘的EMT过程，减轻气道炎症与损伤，通过调节EMT蛋白E-Cadherin和Vimentin的表达变化从分子水平调控EMT，从而达到治疗哮喘的作用。此外，NF-κB活性与哮喘炎症EMT发生相关，抑制NF-κB通路活性可抑制TGF-β1诱导哮喘小鼠EMT的发生，抑制NF-κB通路可减轻哮喘小鼠气道过敏性炎症。

综上所述，OVA 哮喘小鼠存在EMT气道重塑；而BMS-345541可能会通过改变哮喘小鼠气道重塑和气道上皮间质转化，减轻气道重塑，抑制EMT，从而减轻小鼠的哮喘反应。但由于药物对于机体的治疗作用机制十分复杂，BMS-345541是否通过其他分子通路起作用还需进一步研究。