王小琴,邹玉安,薛 茜,常 青,孙 炎

(河北北方学院附属第一医院神经内科,张家口 075000;*通讯作者,E-mail:baiyitiansho@163.com)

缺血性脑血管病具有发病率高、复发率高、致残率高、致死率高等特点,严重危害了人类的健康和生命,因此它的防治逐渐引起了全球关注。早在1990年,Kitagawa等[1]首次发现在沙鼠全脑缺血之前给予一个短暂轻微的脑缺血可以减轻神经损伤,随后该发现引起了全球广泛的关注,这种预先给予的轻微缺血被称为缺血预处理。随后大家发现这种缺血预处理的保护现象存在于多种器官如心脏、肝脏、肾脏等[2-4]。但由于脑缺血预处理操作复杂,临床应用价值不大,而后续大量实验研究发现间断的给予远端肢体数次轻微的、亚致死性的缺血即肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIP),同样可以预先调动内源性保护机制来减轻之后更严重缺血缺氧损伤的过程[5-7],但到目前为止LIP具体的内源性保护机制仍不明确。

大量研究认为,脑缺血再灌注损伤的机制包括兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、炎症反应、Ca2+内流、诱导凋亡等多种途径实现的,并且各途径相互作用形成一个非常复杂的级联反应,最终结果是神经细胞的死亡[8]。近年来研究发现,炎症反应包括上游转录因子的激活和下游炎症因子的释放,在缺血再灌注损伤中起关键性作用[9]。其中核转录因子NF-κB信号通路是调节炎症反应的经典通路。脑缺血再灌注损伤后可以活化NF-κB,进而促进多种炎症因子如TNF-α、IL-6的大量表达,加重炎症反应,而TNF-α、IL-6的产生又可以反过来进一步激活更多NF-κB的表达,进一步损伤脑组织。本研究主要观察LIP是否通过抑制NF-κB信号通路、降低TNF-α、IL-6炎症因子的含量来减轻缺血再灌注损伤,探讨LIP诱导内源性神经保护的机制,为缺血性和缺氧性脑病的临床防治提供有效的策略。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性SD大鼠(14-16周龄)PF/UAF级,体质量(260±15)g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SCXX(京)2014-0004。动物被随机分为3组,sham组(n=12),I/R组(n=36),LIP+I/R组(n=36),后两组又分为1,3,7 d亚组,每组12只,其中4只用于脑梗死体积测定,4只用于脑组织细胞形态观察及NF-κB/p65表达检测,4只用于TNF-α和IL-6含量测定,本实验共使用96只大鼠,剔除造模过程中死亡和造模不成功的大鼠,最终保证各时间点12只大鼠。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗大鼠NF-κB/p65抗体、山羊抗兔SP试剂盒(IgG抗体)、DAB显色盒(美国Santa Cruz公司);氯化-2,3,4-三苯基四氮唑(TTC)染色试剂(美国Amresco公司),TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(南京建成科技有限公司)。Safire2全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan);栓线(北京西浓科技有限公司);生物组织脱水机(美国Thermo)。

1.3 大脑中动脉阻塞模型及肢体缺血模型制作

sham组:将双侧颈总动脉分离干净并暴露;I/R模型组:根据Zea-Longa的方法[10]建立右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)模型;LIP+I/R组:将SD大鼠腹腔麻醉后仰卧固定于手术台上,在两侧股三角处剪毛消毒行纵行切口钝性分离双侧股动脉,用动脉夹将双侧股动脉同时夹闭10 min,随后移去动脉夹恢复股动脉血流10 min,共进行3次,完毕后30 min,再行右侧大脑中动脉(MCAO)模型,方法同上。

1.4 神经功能缺损评分

在术后24 h,大鼠清醒状态下按照Zea Longa 5级评分法[10]进行评定。评分标准:0分,无明显神经损害症状;1分,无对侧前爪完全伸展;2分,行走时对侧旋转;3分,行走时偏斜;4分,不能自主行走。昏迷死亡者剔除实验。

1.5 TTC染色法测定脑梗死体积

分别在实验设计相应时间点,10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠,迅速断头取脑,沿冠状面切成5片,每片厚约2 mm,迅速浸入2%的TTC磷酸盐缓冲液中,37 ℃水浴箱避光孵育30 min,均匀染色后,丢弃TTC,将脑片放入4%多聚甲醛中,放入4 ℃冰箱中固定24 h,逐层拍照:按公式[(各片正反面梗死面积之和/2×片厚)/(各片正反面总面积之和/2×片厚)×100%]计算梗死体积占所取脑组织体积的百分比。

1.6 光镜下观察脑组织细胞形态

将多聚甲醛固定好脑组织切片进行包埋并制成蜡块,再切成4 μm厚度的脑组织石蜡切片。石蜡切片按HE染色步骤经脱蜡、脱水、染色、冲洗、中性树胶封片,光镜下观察脑组织细胞形态。

1.7 免疫组织化学检测NF-κB/p65的表达

脑组织切片经脱蜡、脱水、PBS反复冲洗,进行抗原修复,3% H2O2封闭,10%山羊血清孵育20 min,后加去山羊血清加入一抗工作液,放于4 ℃冰箱过夜;第二天复温20 min,移去一抗,PBS液冲洗3次,每张切片滴加二抗(山羊抗兔IgG),室温孵育20 min,PBS液反复冲洗3次,甩去PBS液,每张切片滴加DAB显色,脱水透明封片。镜下观察并拍照,NF-κB/P65阳性细胞的胞核部分和胞质部分呈现出棕黄色颗粒。记录NF-κB/P65阳性细胞占整个视野的比例,采用Image-Pro plus 6.0图像分析软件进行分析。

1.8 ELISA检测缺血区脑组织TNF-α、IL-6含量

在实验设计相应时间位点,分别将大鼠麻醉后,迅速冰盘上断头取脑,称重,加入1 ∶9倍量的0-4 ℃生理盐水,在冰水浴上机械匀浆得10%脑组织匀浆,将脑匀浆在4 ℃条件下以3 500 r/min低温离心15 min,取上清置于-80 ℃冰箱备用,用于TNF-α、IL-6的测定。具体方法参照试剂盒说明。

1.9 统计学分析

使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,结果用均数±标准差表示,数值变量资料分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA),实验结果以均数±标准差表示。方差齐时组间两两比较采用最小显著差LSD检验,方差不齐时采用Tamhane’sT2法检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能损伤评分结果

在实验设计各时间点,sham组无神经功能损伤症状,LIP+I/R组和I/R组大鼠分别出现不同程度神经功能缺失症状,LIP+I/R组Longa评分较I/R组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.2 各组大鼠脑梗死体积测定结果

在实验设计各时间点,sham组脑组织无梗死病灶,各时间点LIP+I/R组脑梗死体积均较I/R组明显缩小(P<0.01,见表2)。

表1 大鼠缺血再灌注各时间点的Longa评分

Table 1 The Longa scores in rats at each time point after cerebral ischemia reperfusion

组别第1天 第3天 第7天 sham组0 0 0 I/R组2.72±0.43∗2.83±0.46∗2.62±0.51∗LIP+I/R组1.72±0.41∗#1.82±0.56∗#1.69±0.43∗#

与sham组比较,*P<0.05;与I/R组比较,#P<0.05

表2 各组大鼠缺血再灌注各时间点的脑梗死体积(n=4,%)

Table 2 Cerebral infarct volume in rats at different time after cerebral ischemia(n=4, %)

组别第1天 第3天 第7天 sham组0 0 0 I/R组25.76±1.32∗∗44.90±3.43∗∗41.21±3.98∗∗LIP+I/R组20.84±1.74∗#38.17±1.85∗#35.60±1.86∗#

与sham组比较,*P<0.05,**P<0.01;与I/R组比较,#P<0.05

2.3 脑组织病理学变化

光镜下,sham组海马区神经元排列整齐,细胞结构完整,胞质丰富,胞核饱满,核膜、核仁清晰,无明显肿胀、细胞核固缩、碎裂现象;I/R组脑组织梗死区细胞排列紊乱,细胞体积明显缩小,大量细胞的胞核固缩、碎裂,组织间苍白、水肿,几乎观察不到正常组织结构;LIP+I/R组可见细胞排列较规则,细胞损伤程度较轻,部分细胞有体积缩小、细胞核固缩、核碎裂等现象,但与I/R组相比,细胞变性死亡数量明显减少(见图1)。

A.sham组 B.I/R组再灌24 h C.LIP+I/R组再灌24 h图1 HE法染色后光镜下观察大鼠脑组织病理变化 (HE,×400)Figure 1 Histopathological changes of rat brain under light microscope after HE staining (HE,×400)

2.4 免疫组织化学检测脑组织NF-κB/P65阳性细胞

sham组可见极少量NF-κB/P65阳性细胞表达;与sham组比较,LIP+I/R组和I/R组NF-κB/P65阳性细胞表达百分比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);LIP+I/R组较I/R组NF-κB/P65的表达百分比有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2、表3)。

A.sham组 B.I/R组 C.LIP+I/R组图2 免疫组化法检测大鼠脑组织NF-κB/p65的表达 (×400)Figure 2 The expression of NF-κB/p65 in brain tissue of rats by immunohistochemistry (×400)

表3 大鼠缺血再灌注各时间点的脑组织NF-κB/P65表达(n=4,%)

Table 3 Expressions of NF-κB/P65 in brain tissue of rats at each time point after ischemia-reperfusion(n=4,%)

组别第1天 第3天 第7天 sham组 4.23±1.01 5.42±1.78 3.99±0.92I/R组59.76±1.32∗∗67.21±13.21∗∗62.76±16.28∗∗LIP+I/R组36.48±9.27∗∗#40.92±10.25∗∗#34.38±8.66∗∗#

与sham组比较,**P<0.01;与I/R组比较,*P<0.05

2.5 脑组织TNF-α、IL-6含量的变化

与sham组比较,LIP+I/R组和I/R组TNF-α、IL-6的含量第1天开始升高(P<0.05),第3天达高峰,第7天仍高于正常水平,差异有统计学意义。与I/R组比较,LIP+I/R组各时间点TNF-α、IL-6的含量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,见表4,5)。

表4 大鼠缺血再灌注各时间点脑组织中TNF-α的含量(ng/L,n=6)

Table 4 Comparison of content of brain TNF-α in rats among all groups(ng/L,n=6)

组别第1天 第3天 第7天 sham组 84.45±15.54 83.76±15.90 85.34±16.65I/R组112.53±22.32∗157.76±28.87∗118.12±19.76∗LIP+I/R组104.87±22.38∗#138.04±25.65∗#103.40±14.35∗#

与sham组比较,*P<0.05;与I/R组比较,#P<0.05

表5 大鼠缺血再灌注各时间点脑组织中IL-6的含量(ng/L,n=6)

Table 5 Comparison of content of brain IL-6 in rats among all groups(ng/L,n=6)

组别第1天第3天第7天sham组11.09±1.6310.16±2.0811.16±2.08I/R组25.61±3.50∗16.98±2.98∗15.32±2.61∗LIP+I/R组19.05±2.79∗#15.74±2.83∗#13.84±2.14∗#

与sham组比较,*P<0.05;与I/R组比较,#P<0.05

3 讨论

LIP作为一种新的脑保护方法已经被大量实验证实,Ren等[11]发现单次肢体缺血预处理可提供短期保护,但在再灌注14 d内,联合反复远端预处理可以明显改善脑缺血再灌注损伤,但远端肢体与大脑相距离较远,其保护机制仍然不清楚,目前推测其可能是通过神经内分泌系统实现的,可能机制包括抑制自由基毒性、抑制炎症反应、调节一氧化氮含量、增加线粒体功能、减轻兴奋性氨基酸毒性、促进细胞增殖以及抑制凋亡等。NF-κB是广泛存在于神经元及神经胶质细胞内的一种转录因子,它在炎症反应中起至关重要的作用,目前已经发现它可以通过与IL-1、IL-6、TNF-α等基因启动子结合而启动转录功能,产生大量IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子及黏附因子和趋化因子等,导致细胞死亡[12]。同时相关炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α也反过来促进NF-κB表达增强,他们相互促进形成恶性循环,进一步加重损伤。TNF-α作为一个前炎症因子是启动炎症的关键因子,一旦机体出现缺血、缺氧、微生物感染等情况便会引发炎症免疫瀑布,损伤机体,因此,它是脑缺血再灌注损伤过程中一个重要的炎症因子[13]。IL-6作为一种神经营养因子具有多种生物学功能,机体正常情况下其含量较低,对神经元有营养保护和修复损伤的作用。脑缺血后TNF-α、IL-6作为重要的前炎症细胞因子在炎性细胞反应出现之前出现,然后通过复杂的网络来影响其他炎症因子、炎性细胞功能和合成,从而介导随后的缺血损伤。因此抑制NF-κB通路,减少TNF-α、IL-6的含量可以明显减轻炎症反应。

本研究观察了各组NF-κB信号通路中的NF-κB/P56蛋白,以及TNF-α、IL-6的含量,结果发现,脑缺血再灌注的脑组织中NF-κB/P56表达明显增强,TNF-α、IL-6的含量明显升高,并且NF-κB/P56表达的强弱与脑梗死体积大小呈正相关,提示NF-κB参与了脑缺血再灌注损伤的过程,这与Williams等[14]的结果是一致的。而提前给予数次LIP能够降低大鼠神经功能缺损,保护神经元。与此同时,我们也观察到LIP可以降低缺血脑组织中TNF-α、IL-6的含量,表明LIP可能通过抑制NF-κB信号通路的激活来减少TNF-α、IL-6等炎症因子释放从而减轻炎症反应,实现内源性保护作用。