秦学玲，康绍建，马娜，蒋新平，杨璐璐

丹参片是以唇形科植物丹参为原料而制成的片剂，具有活血化瘀等功效[1]。丹参片对军事训练中的急慢性损伤均具有较好的活血化瘀及缓解肿痛的作用。丹参片的主要成分为以丹酚酸B为代表的水溶性成分和以丹参酮ⅡA为代表的脂溶性成分[2-12]。笔者在前期研究的基础上，参考相关文献[2-16]，运用UPLC法对抽到的全部批次丹参片样品开展了指纹图谱的研究，建立了丹参片的UPLC指纹图谱共有模式，确定了13个峰为共有峰，所有样品的相似度均在0.90以上；指认了其中的11个共有峰。该方法能在30 min内检测丹参片中的多种成分，操作简便、快速，可为丹参片的整体质量控制提供参考。

本研究起止时间为2015年2—12月。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 UPLC仪Agilent Technologies 1290 lnfinity系统，(美国安捷伦公司)；天平：AW220电子天平(日本岛津公司)；对照品丹参素钠(批号201403)、迷迭香酸(批号201203)、丹酚酸B(批号201407)、丹参酮ⅡA(批号201409)、原儿茶醛(批号201307)、丹参酮Ⅰ(批号201209)、隐丹参酮(批号201312)、熊果酸(批号201209) 均购自中国食品药品检定研究院；紫草酸(批号27342-47-5)、丹酚酸A对照品(批号98361-23-6)、二氢丹参酮Ⅰ对照品(批号68351-80)均购自西亚公司，标示含量均大于99%；乙腈为色谱纯，水为高纯水(自制)，其它试剂均为分析纯；丹参片为从 8个生产厂家抽取的74批次样品。

1.2 色谱条件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱，以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0～10 min,4%B→18%B;10～15 min,18%B→33%B;15～19 min,33%B→49%B;19～37 min,49%B→79%B);柱温19 ℃,样品管理器温度3.5 ℃;流速为0.25 mL/min;以丹酚酸B为参照峰，检测波长280 nm。

1.3 对照品溶液的制备 取丹参素钠；二氢丹参酮；隐丹参酮；丹参酮Ⅰ；丹参酮ⅡA；熊果酸；原儿茶醛；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸B；丹酚酸A对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为0.713 2、0.075 03、0.160 2、0.090 4、0.180 3、0.300 2、0.083 7、0.399 1、0.330 3、0.499 5、0.413 2 mg/mL的对照品溶液，即得。

1.4 供试品溶液的制备 取供试品适量，除去包衣，研细，取约0.2 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入75%甲醇适量，超声处理25 min(功率：300 W；频率：50 kHz)，放冷用75%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.5 阴性样品溶液的制备 取由宁夏启元国药有限公司提供的阴性样品，照“1.4”项下的方法制备，即得。

1.6 方法学考察

1.6.1 精密度试验 取批号为141211的丹参片参照“1.4”项下方法制备丹参片样品溶液，重复进样6次，参照“1.2”项下色谱条件进行测定，以5号峰(丹酚酸B)为参照峰，计算13个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积相对标准偏差(RSD)。结果表明，13个色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.2%，相对峰面积RSD均小于1.0%。说明该仪器具有较好的的精密度。

1.6.2 重复性试验 取批号为141211的丹参片参照“1.4”项下方法制备6份丹参片样品溶液，参照“1.2”项下色谱条件进行测定，结果显示指纹图谱相似度的值均在0.98以上,13个色谱峰相对保留时间RSD均小于0.2%，相对峰面积RSD均小于1.0%。说明所建立的方法具有较好的重复性。

1.6.3 稳定性试验 取批号为141211的丹参片参照“1.4”项下方法制备丹参片样品溶液，参照“1.2”项下色谱条件分别于0、3、6、9、14、22 h内进行测定，结果显示指纹图谱相似度值为1,13个色谱峰相对保留时间RSD均小于0.2%，相对峰面积RSD均小于1.0%。说明，丹参片样品溶液在室温放置22 h内比较稳定。

1.7 指纹图谱的建立

1.7.1 共有峰的归属 取批号为141211的丹参片参照“1.4”项下方法制备丹参片样品溶液，取“1.3”项下制备对照品溶液；参照“1.2”项下色谱条件进行测定。指认了11个主要色谱峰，从左到右依次为：丹参素钠(1号峰)、原儿茶醛(2号峰)、迷迭香酸(3号峰)、紫草酸(4号峰)、丹酚酸B(5号峰)、丹酚酸A(6号峰)、二氢丹参酮Ⅰ(8号峰)、丹参酮Ⅰ(9号峰)、隐丹参酮(10号峰)、熊果酸(11号峰)、丹参酮ⅡA(13号峰)。

1.7.2 指纹图谱共有模式的建立及数据处理 对所抽到的8个生产厂家74批次丹参片样品进行测定，生成丹参片的指纹图谱共有模式，详见图1～9。并对74批丹参片样品UPLC指纹图谱进行了分析，以丹酚酸B为参照峰S，确定了13个峰为共有峰,计算其相似度，详见表1,2。

2 结果

(1)通过对不同企业指纹图谱的建立与分析可知(详见图2和表1)，供试品色谱图的相似度均在0.9以上。其中E企业样品相似度最好(相似度：0.998)，说明其产品质量控制较好，而C企业样品相似度相对较差(相似度：0.901)，说明其产品质量控制相对较差。

(2)通过对同一企业不同批次间指纹图谱的建立与分析可知(见图3～9和表2)，供试品色谱图的相似度均在0.900以上，均符合规定，合格率为100%。其中E企业各批次间的样品相似度最好，其相似度范围为0.998～1.000，说明其整个过程中批次间产品质量控制较好，而C企业各批次间的样品相似度相对较差，其相似度范围为0.910～1.000，说明其整个过程中批次间产品质量控制较差，这与前期调研和提取工艺的研究结果基本一致。

(3)本研究建立的方法能在30 min内检测丹参片中的多种成分，操作简便、快速，具有较好的专属性和稳定性，可为丹参片的整体质量控制提供参考。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择 本实验在前期研究的基础上，参考相关文献[2-16]，最后确定供试品溶液制备方法为：取供试品适量，除去包衣，研细，取约0.2 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入75%甲醇适量，超声处理25 min(功率：300 W；频率：50 kHz)，放冷，用75%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，用0.2 μm微孔滤膜滤过，即得。

图1 丹参片UPLC图谱(共有模式)：A为混合对照品，B为丹参片样品，C为阴性样品

图2 8个不同生产企业丹参片样品的UPLC指纹图谱

图3 企业A丹参片样品的UPLC指纹图谱

图4 企业B丹参片样品的UPLC指纹图谱

图5 企业C丹参片样品的UPLC指纹图谱

图6 企业D丹参片样品的UPLC指纹图谱

图7 企业E丹参片样品的UPLC指纹图谱

图8 企业F不同批次间丹参片样品的UPLC指纹图谱

图9 企业G丹参片样品的UPLC指纹图谱

企业名称相似度数据文件对照图谱.Scp1.000A企业-280.cdf0.915B企业-280.cdf0.980C企业-280.cdf0.901D企业 -280.cdf0.911E企业 -280.cdf0.998F企业 -280.cdf0.923G企业 -280.cdf0.916H企业 -280.cdf0.991

表2 各企业不同批次间丹参片指纹图谱相似度范围分析结果

注：限度规定相似度不得低于0.850

3.2 色谱条件的选择 本实验在前期研究的基础上，参考相关文献[2-16]，最后确定色谱条件为：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱，以0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0～10 min,4%B→18%B;10～15 min,18%B→33%B;15～19 min,33%B→49%B;19～37 min,49%B→79%B);柱温19 ℃,样品管理器温度3.5 ℃;流速为0.25 mL/min;以丹酚酸B为参照峰，检测波长280 nm。

3.3 参照峰的选择 酚酸性成分是丹参片中一类主要活性成分，其中丹酚酸B为丹参片中酚酸性成分的代表，其在丹参片中的含量最高，并且是2015版中国药典规定的含量测定项目，因此我们选择丹酚酸B作为参照峰。

3.4 不足 因H企业只抽到1批次样品，所以未作批次间指纹图谱的研究。