宋 伟，韩 芳，丁 磊，周典兵，贾学颖，吕亚宁，邓晓军，郑 平*，盛 旋，胡艳云

(1.安徽出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，安徽 合肥 230022；2.食品安全分析与检测安徽省重点实验室，安徽 合肥 230022；3.上海检验检疫科学技术研究院，上海 200135)

生姜精油为姜块茎经干燥、磨碎并用水蒸气蒸馏制得的挥发油[1]，主成分为姜烯、生姜酚、姜醇、姜酮、柠檬醛、水芹烯等[2-3]。生姜精油主要用于配制食用香精、含酒精饮料、软饮料和糖果，也用于香水等化妆品。在个人护理品领域，生姜精油因具有消散淤血、促进血液循环之功效被广泛用作单方或复方精油[4-6]。但由于生姜精油成分复杂，产地分散，加之生长环境和生产工艺的影响，易造成产品品质的差异，开展科学有效的生姜精油分析、评价方法，对于该类产品的质量控制、掺假识别、产地溯源等具有重要意义。

目前生姜精油的检测方法主要为气相色谱法，但该方法易导致样品中相关成分发生热分解，且检测时间长。超高效合相色谱技术(Ultra performance convergence chromatography，UPC2)兼具超临界流体色谱与传统高效液相色谱的优点，以超临界CO2为流动相主体，黏度系数较低、传质性能好，既能分析不适用于气相色谱的高沸点、低挥发、遇热不稳定样品，又具有比高效液相色谱更高的选择性和更快的分析速度，且无需大量的有机试剂作流动相，绿色环保。UPC2技术已成功应用于食品检测、中药成分检测及质量控制、脂类和脂肪酸类分析、天然产物分析等领域[7-15]，但在精油分析领域的应用研究较少。将UPC2技术应用于生姜精油特征图谱采集分析，既可避免热不稳定成分发生分解，又可缩短样品分析时间，为生姜精油分析提供了一种新手段。

目前特征图谱结合数理统计方法在产品质量控制、掺假识别及产地溯源等方面已有一定应用[16-18]。本文采用超高效合相色谱建立了生姜精油的特征峰二极管阵列(PDA)光谱谱图库及标准对照特征图谱采集方法，并利用聚类分析及主成分分析法对不同产地生姜精油进行了区分。该方法无需衍生化处理，样品直接稀释后进样，操作简便、快速，绿色环保，可应用于生姜精油的质量控制及产地溯源。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity超高效合相色谱仪，配ACQ-UPC2-PDA 检测器(美国Waters公司)；CO2(纯度≥99.999%，合肥众益化工产品有限公司)；甲醇、异丙醇、乙腈、正庚烷、异辛烷和正己烷均为色谱纯(美国Tedia公司)；0.22 μm有机滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)。生姜精油由安徽省土产进出口有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 超高效合相色谱条件Acquity UPC2HSS C18SB色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱温为40 ℃；系统背压为13.8 MPa；柱流速为0.8 mL/min；样品室温度为20 ℃；进样量为4 μL；PDA波长采集范围为200～310 nm；流动相为超临界CO2(A)，助溶剂为乙腈(B)。梯度洗脱程序：初始流动相100%A,保持2 min；2～3 min，100%～99.8%A，保持2 min；5～6 min，99.8%～99.5%A，保持2 min；8～10 min，99.5%～98.0%A，保持2 min；之后由98.0%A升至100%A，保持5 min。

1.2.2 样品处理取生姜精油适量以正庚烷稀释10倍，过0.22 μm有机滤膜后直接进行UPC2分析。

1.2.3 数据分析利用仪器Empower软件中光谱检索功能，以生姜精油特征峰的PDA光谱图建立光谱谱图库，将样品色谱峰的出峰时间及光谱图与生姜精油特征峰PDA谱图库检索比对，识别生姜精油的特征成分。比较样品色谱图与标准特征图谱，进行相似度评价。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 稀释溶剂及流动相助溶剂的选择根据生姜精油的稀释溶解性，考察了正己烷、正庚烷、正庚烷-异丙醇(体积比1∶1)3种稀释溶剂的影响。结果显示，采用正己烷、正庚烷溶解稀释时，生姜精油的超高效合相色谱图差异不大，但稀释溶剂中加入异丙醇后，部分成分的色谱峰分离度变差。由于正庚烷的毒性较低，综合考虑最终选择正庚烷为样品稀释溶剂。UPC2的流动相主要是超临界CO2，加入甲醇、异丙醇、乙腈等助溶剂可使超临界流体的溶剂化能力增强，增大流动相对目标物的溶解性，改善目标化合物的保留时间及峰形[19]。实验发现，当采用100%超临界CO2进行分离时，由于流动相极性太弱，生姜精油的多数特征成分不能被有效洗脱。为改善分离效果，考察了甲醇、异丙醇、乙腈、正己烷-异丙醇(4∶1)4种助溶剂对生姜精油特征图谱的影响。结果表明，甲醇、异丙醇两种助溶剂的洗脱能力过强，对于部分化合物无法有效分离；正己烷-异丙醇(4∶1)的洗脱能力较弱，色谱峰分离时间较长，峰形较差；而采用乙腈梯度洗脱时，色谱峰分离效果相对较好，且对于紫外吸收波长较低化合物的影响更小，基线更平稳。实验最终选择乙腈为助溶剂。

2.1.2 动态背压的选择动态背压(ABPR)决定CO2的超临界流体状态，是影响超高效合相色谱分离过程的重要因素。不同的动态背压下，超临界CO2对样品的溶解能力不同[20]。考察了动态背压(11.0、12.4、13.8、15.2、16.5 MPa)对样品分离度的影响。结果显示，当动态背压为11.0 MPa时，超临界CO2流体密度较小，溶解能力差，不能对生姜精油中的化合物进行有效分离洗脱。随着动态背压的增大，超临界CO2流体的洗脱能力增强，生姜精油中化合物得到分离，且保留时间提前，但超临界CO2的流体密度及黏度随之增加，柱压升高。综合考虑，选择动态背压为13.8 MPa。

图1 生姜精油的3D超高效合相色谱图Fig.1 3D UPC2 chromatograms of ginger essential oil

图2 11批生姜精油的超高效合相色谱特征图谱(214 nm)Fig.2 UPC2 specific chromatograms of 11 ginger essential oils(214 nm)

2.1.3 梯度洗脱条件的优化实验发现，初始流动相中含有少量助溶剂时，会造成色谱峰过于集中。为改善目标化合物的峰形及保留时间，梯度洗脱条件设置初始流动相为100%CO2，运行2 min后再缓慢加入少量助溶剂，从而增强了生姜精油成分的分离效果。在“1.2.1”最佳色谱分离条件下，获得生姜精油的3D超高效合相色谱图(见图1)，整体分离效果较好且采集时间较短。

2.2 方法学考察

考虑到样品在214 nm波长下的色谱峰较为丰富，且强度均衡，最终选择在214 nm下建立生姜精油的超高效合相色谱特征图谱。以同一稀释样品连续采集色谱图6次，共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.83%～1.6%和1.2%～2.0%，仪器稳定性和精密度良好。制备稀释样品6份，分别采集色谱图，共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为1.0%～1.9%和 1.4%～2.4%，方法重现性良好。制备稀释样品分别于 0、4、8、12、16、20、24 h 进样分析，记录色谱图，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD分别为1.4%～2.3%和 1.6%～2.8%，方法稳定性良好。

2.3 安徽产生姜精油标准特征图谱的建立

连续采集11批安徽产生姜精油样品的超高效合相色谱特征图谱，选择峰形较好、共有率大于70%、相对保留时间及光谱图匹配度高的峰作为共有特征峰，最终标记出20个共有特征峰(见图2)。采用中位数矢量法，以所有共有特征峰的相对保留时间和平均峰面积建立生姜精油的标准特征图谱，并以特征峰的PDA光谱图建立光谱谱图库。

选择夹角余弦法作为相似度评价依据，对不同图谱进行相似度评价，所得相似度数值越接近1，说明图谱间的相似度越高[21]。另取10份安徽产生姜精油样品进行超高效合相色谱特征图谱采集，与生姜精油的标准特征图谱进行相似度评价。结果显示，10份生姜精油色谱特征图谱的相似度均大于0.9，表明所建立的标准特征图谱代表性良好，可应用于相关产品质量控制。

图3 20份生姜精油的聚类分析图Fig.3 Dendrogram of 20 ginger essential oils

图4 20份生姜精油的主成分分析得分投影图Fig.4 PCA scatter PC1-PC2 biplot grouping of 20 ginger essential oils

2.4 产地溯源分析

2.4.1 聚类分析对20批不同来源的生姜精油进行超高效合相色谱特征图谱采集，其中1～10号生姜精油为安徽产地样品，11～20号为山东产地样品。以20个共有峰峰面积为变量，应用SPSS 19.0统计软件，采用组间连接的方法，以欧氏距离、平方欧氏距离、马氏距离、闵氏距离等常用Q型聚类进行对比，确定平方欧氏距离效果最好。以平方欧氏距离为度量准则，对20批样品所得数据进行聚类分析，结果见图3。由图3可知，20批生姜精油可被分为两大类，1～10为第Ⅰ类，11～20为第Ⅱ类。两个产地的生姜精油样品实现了区分。

2.4.2 主成分分析运用PCA分析法对不同产地样本各特征峰的响应值计算因子特征值和方差分析，结果表明前2个主成分的特征值大于1，分别为14.070和3.798，累计方差贡献率为89.34%，所以选取前2个主成分。根据PCA总贡献率超过85%即可使用的原则[11]，前2个主成分能够代表生姜精油超高效合相色谱特征峰的整体信息，原来20个变量反映的信息可由2个主成分反映。利用主成分1和2的标准化得分作图，可以看出不同产地生姜精油有各自的分布空间(图4)。超高效合相色谱特征图谱技术结合主成分分析可以应用于不同产地生姜精油的区分，但基于样本的局限性，仍需扩大采样量和采样地区，进而筛选并建立更有效的溯源和判别模型。

3 结 论

通过对样品稀释溶剂、流动相助溶剂、动态背压等分离条件的优化，建立了生姜精油的UPC2-PDA谱图库及生姜精油特征图谱采集方法。以相对保留时间结合PDA光谱图检索识别超高效合相色谱特征峰，对样品特征图谱与标准特征图谱进行相似度评价，可应用于生姜精油产品质量控制。同时结合聚类分析、主成分分析等化学计量学方法对生姜精油产地溯源进行了初步探索，成功对20批不同来源的样本进行了区分。所建立的生姜精油UPC2特征图谱技术具有过程简单、分析时间短、环境污染小等特点。但由于样品数量和产地来源较少，致使实验结果存在局限性，后续需进一步扩大样本量，建立并完善溯源和判别模型，以更好地应用于生姜精油质量鉴定及产地溯源。