杨若颖，李 婵，叶明亮，张丹阳，冯俊涛,2，闫 合,2

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；2. 西北农林科技大学 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

植物源农药的主要成分来源于自然，具有选择性高、低毒、易降解，害物不易产生抗药性等优点[1], 从植物中寻找抑菌活性物质, 是研发新型杀菌剂的热点之一。瑶医药是瑶族人民长期与疾病作斗争的智慧结晶，104 味经典老班药中，很多是治疗细菌感染的药物，这为新型抑菌活性物质的发现提供了线索。事实上，虽然国内外对具农药活性植物的筛选一直没有停止，但针对瑶药的农用活性筛选却少见报道。本研究对我国部分瑶药植物的甲醇提取物进行抑菌活性的筛选，旨在筛选出具有较高活性抑菌植物，为开发新型植物源农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料烟草青枯菌(Ralstoniasolanacearum)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)标准菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923购买自广东省微生物菌种保藏中心。供试瑶药购买自广西省南宁市大福子原生草药店，并由西北农林科技大学生命学院李琰副教授鉴定。31种瑶药及其科属见表1。分析纯甲醇和分析纯DMSO购自四川西陇化工有限公司；电子天平， ALC-1100.2，北京赛多利斯仪器系统有限公司；旋转薄膜蒸发仪，R205B型，上海申生科技有限公司；超声波清洗器，KQ-250B，昆山市超声仪器生产公司；循环水式多用真空泵，SHB-B95A型，郑州长城科工贸易有限公司。

1.2 瑶药样品的提取采用超声波提取法将阴干的植物材料在40 ℃下烘干，粉碎后过40目筛，放入自封袋中。试验前称取50 g的植物干粉，加入甲醇进行超声波提取，每次60 min，重复提取3次。过滤后浓缩，保存于4 ℃冰箱内待用。

1.3 培养基配制方法室内生测用于活化细菌性病原菌菌株的液体培养液(LB培养基): 称取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠3 g, 加水定容至1 L, 灭菌锅灭菌待用。

1.4 药剂配制采用对供试病菌没有抑菌作用的二甲基亚砜作为溶剂, 将供试瑶药提取物溶解。用二甲基亚砜-水溶液将各瑶药提取物按其有效成分含量溶解稀释成1 000 mg·L-1药液 (作为母液备用)。

1.5 供试菌种的准备将供试菌种在试验前1 d转接到LB培养液中, 置于28℃恒温摇床箱中活化12 h。

1.6 室内抑菌活性筛选和最低抑菌浓度(MIC)测定方法采用二倍稀释法对瑶药提取物进行室内抑菌活性筛选和最低抑菌浓度(MIC)测定[2]。测定方法: (1) 室内抑菌活性筛选方法：实验操作在96孔板上进行, 每孔加入50 μL稀释后细菌数量达104cfu·mL-1的供试菌菌悬液与50 μL质量浓度为1 000 mg·L-1药液，使药液最终浓度为500 mg·L-1，培养24 h后观察结果；再进一步将母液稀释为200 mg·L-1药液，实验操作方法同上，使药液最终浓度为100 mg·L-1，培养24 h后观察结果；(2) 最低抑菌浓度(MIC)测定方法：取编号为1～5的试管以及适量的蒸馏水，放入灭菌锅里灭菌待用。灭菌完成后，除1号试管加入4 mL无菌水外，其余试管均加入2 mL无菌水。将1 mL配制好的质量浓度为1 000 mg·L-1的母液加入1号试管中，混合均匀后，将混合后的药液取2 mL加入到2号试管中，以此操作至5号试管为止。使药液浓度稀释为200，100，50 ，25，12.5 mg·L-1共5个浓度。在96孔板上每孔加入50 μL稀释后细菌数量达104cfu·mL-1的供试菌菌悬液与50 μL药液，使药液最终浓度为100，50，25，12.5，6.25 mg·L-1，以硫酸链霉素作为对照药剂。培养24 h后，通过肉眼比对发现微孔内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生, 则此微孔对应的药液浓度即为此提取物对待测病菌的MIC值。

2 结果与分析

2.1 31种瑶药提取物对烟草青枯菌的室内抑菌活性筛选采用二倍稀释法在500，100 mg·L-1的浓度下，测定了31种瑶药植物的甲醇提取物对烟草青枯菌的抑菌活性实验，结果表明：在500 mg·L-1的浓度下有18种瑶药提取物表现出显著的抑菌活性，在100 mg·L-1的质量浓度下有3种瑶药提取物表现出显著的抑菌活性(表1)。

表1 供试瑶药对烟草青枯的初筛活性Tab.1 Primary screening of antibacterial activity of Yao medicinal plants against Ralstonia solanacearum

续表1 Continued Tab.1

注：1.对烟草青枯菌的活性测定采用二倍稀释法；2.“抑菌活性”列，标注“+”和“-”分别表示该样品“具显著抑菌活性”和“无显著抑菌活性”
Note：The activity ofRalstoniasolanacearumwas assayed by double dilution method; the ‘ +’ and ‘-’ in the column of inhibitory activity indicate 'significant inhibitory activity and no significant inhibitory activity, respectively.

2.2 抑菌活性显著的瑶药提取物的MIC测定结果采用二倍稀释法对穿破石、独脚风、贯众等3种瑶药提取物进行最低抑菌浓度测定(表2)。结果表明：3种瑶药提取物对烟草青枯菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的抑制效果。3种瑶药提取物对烟草青枯菌的MIC分别为25，25，25 μg·mL-1，对蜡状芽孢杆菌的MIC分别为12.5，50，50 mg·L-1，对金黄色葡萄球菌的MIC分别为50，25，50 mg·L-1。

表2 3种瑶药提取物对烟草青枯菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC测定结果Tab. 2 Assay of MIC of extracts of three species of Yao medicinal plants against R.solanacearum, B.cereus, S.aureus

续表2 Continued Tab.2

注：1.“-”表示无细菌生长，培养液澄清透明无沉淀；2.“+”表示有细菌生长，培养液浑浊有沉淀
Note：“-” indicates no bacterial growth, and the culture solution was clear, translucent and contained n precipitation; “+” indicates bacterial growth and the culture solution was not clear and contained precipitations.

3 讨 论

我国对具农药活性植物的筛选，一般是参考《本草纲目》等古籍和《中国土农药志》《中国有毒植物》等专著及在生产中人们使用的土农药[3]。前期，国内多位学者对我国陕、甘、青、新、宁、苏、粤、桂、鄂、闽、川、黔等地区的2 000 多种野生植物或中草药进行了农用活性的筛选，发现了砂地柏、牛心朴子、掌叶千里光、辛夷、广陈皮、博落回等多种植物具有较好的杀虫活性；茄科、百部科、藜科、马钱科、豆科、菊科、仙茅科、玄参科、芸香科、天南星科、姜科、唇形科、菊科、桔梗科、忍冬科、伞形科、蓼科、大戟科等植物的杀虫活性值得深入研究；豆科、禾本科、菊科、伞形科、十字花科、马兜铃科、唇形科、葫芦科、蓼科、木兰科、百合科、木犀科、莎草科和樟科等植物的杀菌活性具开发应用前景。近 10 余年来，国内学者筛选的范围进一步扩大，同时更加注重对植物源物质特殊生物活性的发现[4]。

瑶族是我国少数民族之一，在广西生活的瑶族占全国瑶族总人口60%以上，大多聚居在金秀、巴马、都安、大化、富川和恭城等6个瑶族自治县内。瑶族人民在长期的生活实践中总结出一套有效的防病、治病经验，其方法简单实用，疗效确切。瑶医药是瑶族人民长期与疾病作斗争的智慧结晶，具有鲜明的民族特色，瑶族医药历来靠口传心授、代代相传而得以传承。在各级政府和诸多瑶医药专家的共同努力下《瑶医效方选编》《中国瑶医学》《实用瑶医学》《中国现代瑶药》等著作先后出版，标志瑶医药的理论体系初步形成[5]。由于瑶族生活区域湿热的气候特点，使瑶药具有不同于北方中医药系统的特色。104 味经典老班药中，大多数为治疗细菌感染的药物，而这可以给杀菌剂的发现提供重要的线索。因此，本研究针对瑶药开展抑菌农用活性筛选，采用二倍稀释法筛选了31种瑶药提取物的抑菌活性, 并测定了初筛高活性瑶药提取物对烟草青枯菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。结果表明，穿破石、独脚风、贯众3种瑶药提取物均具有显著抑制烟草青枯菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等3种植物病原细菌的活性。

有研究表明，穿破石根提取物对梨锈病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌以及玉米炭疽病菌有很高的抑菌活性[6], 绵马贯众醇提液和水提液对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌、白喉杆菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用[7]。由此可见，穿破石、贯众有多种抑菌活性，然而独脚风的抑菌活性却少见报道。因此，穿破石、独脚风、贯众这3种瑶药有开发为新型植物源杀细菌剂的潜力，值得进一步深入研究。