王婷婷，韩 影，高芳芳，叶 磊，张育军

0 引 言

外泌体（exosomes）是由细胞向细胞外主动分泌的具有典型磷脂双分子层结构的一种囊泡，其大小介于30～200 nm之间［1-2］。外泌体内含有细胞来源的各种蛋白质、核酸及脂质分子，在细胞-细胞间物质传递及信息交流具有重要作用，参与了多种疾病的发生［3-4］，外泌体亦可作为药物载体及疾病的治疗靶点［5］。

目前所研究的外泌体主要来自于各种体液如血液、尿液、腹腔积液、胆汁等及细胞上清液中［6］。由于外泌体的获取及操作较为简便，且内容物丰富，因此已成为临床及基础研究的热点，对于疾病的诊断和治疗具有不可比拟的优势。外泌体的提取、鉴定已有较多研究报道［7-8］，经典的提取方法有超速离心法、PEG沉淀法及超滤法等。但是其保存方法、保存时间、保存效果的评估研究较少［9］，体液保存时间及温度对于其中外泌体的生物学特性的影响亦鲜少报道。由于临床取材具有例数少、频次高的特点以及生物样本库的广泛开展，使得样本保存至超低温冰箱批量处理成为可能。因此本研究主要围绕保存在超低温环境下的不同时间血浆及血清样本中外泌体的生物学特性进行展开。主要观察不同保存时间的血浆及血清中外泌体的大小、密度、形态及阳性蛋白表达有无改变。

1 材料与方法

1.1 材料本研究使用新鲜采集及1、3、5年前收集后冻存在-80℃冰箱的血浆及血清各3份，均来自于北京大学人民医院生物样本库。血浆及血清外泌体提取使用SBI Exoquick试剂盒，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光液来自美国Thermo Fisher公司。外泌体中蛋白Western blot所用一抗TSG101和CD63抗体均使用Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌体提取血浆及血清外泌体提取使用Exoquick试剂盒，操作方法遵循说明书。具体操作步骤如下：血清血浆4℃，10 000×g离心10 min预处理，随后将离心得到的上清转移至新的离心管，按照250 μL血清血浆的体积加63 μL Exoquick试剂的配比加入Exoquick试剂，4℃静置30 min。离心1500×g，30 min，弃上清，得到的沉淀用 200 μL 1x PBS重悬即为外泌体。

1.2.2 外泌体粒径分析经过Exoquick试剂盒提取得到的外泌体取50 μL加950 μL 1xPBS进行1∶20稀释，使用0.22 μm滤膜过滤外泌体稀释液。过滤后的外泌体悬液直接使用纳米粒度颗粒跟踪分析仪（NanoSight NS 300）进行粒径检测，使用软件NTA 3.2 Dev Build 3.2.16进行分析。NanoSight NS 300配备sCMOS相机进行拍摄，激光类型为Blue488，快门317，增益15。每个样本重复3次。

1.2.3 外泌体透射电镜本研究采用1%醋酸乙酰铀负染法对外泌体进行透射电镜观察。外泌体电镜制备方法参考SBI公司提供的‘TEM Serum Procedure with Exoquick’电镜操作流程。具体操作步骤如下：血浆及血清冰上融化后，取500 μL加100 μL Exoquick试剂，4℃放置2 h以上。随后3000 r/min离心 20 s，弃上清，加 450 μL 1xTBS缓冲液溶解。取10 μL稀释10倍后，4%多聚甲醛固定10 min。将不同样品的外泌体悬浮液（约5 μL）滴至包被聚醋酸甲基乙烯脂的碳化铜网上，室温放置4～5 min，滤纸吸干残余液体。滴加负染液1%水醋酸双氧铀（5 μL）于铜网上反应1 min，然后用滤纸吸干，清洗2遍。使用透射电镜JEM1400PLUS（JEOL USA Inc.，Peabody，MA）高压120 kV及UltraScan 4000电荷耦合摄像机及First Light Digital Camera Controller（Gatan Inc.，Pleasanton，CA）进行拍照。

1.2.4 Western blot法参照文献［10］，选择膜结合蛋白TSG101和跨膜分子CD63作为外泌体的外泌体阳性表达标志物。使用Western blot对外泌体中的蛋白进行检测，对比分析同样体积、不同保存时间的血浆及血清外泌体蛋白的表达变化情况。血浆及血清中提取后的外泌体取50 μL加等量的RIPA裂解液进行裂解，BCA法测定蛋白浓度，上样量70 μg，使用12.5%的分离胶及5%浓缩胶进行SDS-PAGE胶蛋白电泳，恒压80 mV，120 min。外泌体标志蛋白CD63转膜条件为恒流200 mA，70 min，TSG101转膜条件为200 mA，100 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗孵育过夜。1×TBST洗3遍后，抗兔二抗室温孵育1 h，1×TBS洗3遍后ECL发光。

2 结 果

2.1 不同保存时间的血浆及血清外泌体数量及大小保存时间达3年的血浆中的外泌体粒径较大（30～200 nm）。外泌体粒径大小的峰值整体较小（＜100 nm），考虑原因可能与提取方法有关。此外，1 mL血清或血浆能提取到的外泌体数量在1×1010以上，其中血清中外泌体数量较血浆中数量略高，见表1。

2.2 不同保存时间的血浆及血清外泌体形态通过外泌体透射电镜观察，发现不同保存时间的外泌体形态无太大变化，均为圆形或类圆形结构，杯托状结构不典型，见图1。

表1 不同保存时间血浆及血清中外泌体的粒径、数量分析(xˉ±s)Table 1 Diameters and numbers of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time(xˉ±s)

2.3 不同保存时间的血浆及血清外泌体蛋白表达情况保存5年的血浆及血清外泌体中TSG101的表达发生明显降低，CD63分子在保存时间超过1年的血浆及血清外泌体中均发生明显降低，且保存时间越久，其表达水平越低。此外，对比血浆及血清外泌体中的蛋白表达情况可以发现血清中外泌体蛋白表达量，见图2。

图1 镜下观察不同保存时间的血浆及血清中的外泌体Figure1 Transmission electron microscopic images of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time

图2 不同保存时间的血浆及血清中外泌体标志性蛋白表达情况Figure 2 Expression of the protein biomarkers of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time

3 讨 论

提纯好的外泌体保存温度及保存时间对其生物学特性的影响已有相关报道。Park等［9］分别对比了卡波式肉瘤感染的人类脐静脉内皮细胞上清液中提取的外泌体在37℃、4℃、-20℃及-70℃的不同保存温度下的形态学及生物学特性改变，其发现随着保存时间（1～25d）的延长，外泌体的直径减小，密度亦降低（-70℃除外）。其CD63及CD81的蛋白表达在37℃环境下随时间延长而发生减弱，不同保存条件下的外泌体处理正常人类静脉内皮细胞后发现在37℃和-20℃时随着时间延长其补体激活功能逐渐降低。另一篇报道指出，外泌体提取后保存至4℃和-80℃条件下会导致其直径变大，且不同保存条件下其外泌体内含蛋白可检测到的种类及数量存在较大差异［11］。Kalra等［12］报道外泌体中TSG101蛋白在超低温条件下存放90d依然可被检测到，然而更长时间的研究尚未报道。我们的研究进行了不同保存时间下血浆及血清中外泌体中蛋白表达的对比，结果发现保存时间5年的血浆外泌体中TSG101及CD63表达明显降低，此种变化在血清中变化更为明显，而保存时间较短的血浆及血清中外泌体蛋白改变不明显。因此进行外泌体中蛋白表达研究时血浆或比血清更具优势。此外，提纯后的血浆外泌体保存一定时间后或不如将血浆保存至超低温条件待实验准备好后进行批量提取再进行相应研究。除了对比不同保存时间血浆及血清中蛋白的表达改变情况，本研究还通过外泌体粒径分析、电镜下观察外泌体形态改变综合评估了不同保存时间下外泌体物理特征的改变。我们发现不同保存时间的外泌体形态无太大变化，均为圆形或类圆形结构，杯托状结构不典型，可能与外泌体提取方法及透射电镜制片方法有关。但是其大小和形态均符合外泌体的一般表现，因此说明保存时间及样本类型对外泌体的大小和形态学变化无太大影响。

Chen等［13］的研究中表明保存时间超过5年的血浆中外泌体磷酸化蛋白尚能被检测，我们选取TSG101胞质蛋白和CD63跨膜蛋白作为外泌体蛋白稳定性的指示物，仅具有一定的代表性，未进一步进行磷酸化蛋白的稳定性检测，此为本研究的不足之处。外泌体内除了含有蛋白质亦具有丰富的RNA及DNA等核酸物质［14］，不同的外泌体分离方法和RNA提取方法分离及提取出的外泌体中RNA表达具有一定的差异性［7，15］，然而保存时间对于外泌体中RNA表达的影响目前尚无相关报道。由于本研究中血浆及血清的体积较小，未能进行RNA的检测，亦为本研究不足之处。

外泌体提取方法目前已有较多研究，超速离心法目前仍为最经典的方法，然而因其得率低、对样本量要求较高及超速离心对外泌体的损伤影响限制了其广泛的应用［16］。本研究使用基于PEG沉淀原理的Exoquick试剂盒法提取外泌体，充分提升了其得率，降低了初始样本要求体积并能有效保护外泌体的形态完整性。有研究表明不同提取方法对于外泌体的物理学特性及生物学功能无太大影响［7］，另一篇关于外泌体提取方法的研究表明Exoquick试剂盒法与超速离心法提取的外泌体纯度及质量均较高［8］。因此，对于样本较珍贵且样本量有限的研究推荐使用试剂盒法进行外泌体提取。

综上，本研究对比了不同保存时间的血浆及血清中外泌体的生物学特性，表明保存时间对于外泌体大小及形态无明显影响，但是其标志性蛋白TSG101、CD63的表达随着保存时间的延长具有明显降低，尤其在保存时间超过3年时，因此进行外泌体内蛋白质的相关研究时推荐新鲜提取立即实验。外泌体分布于各种体液中，其取样过程对于临床患者具有很大的便捷性及依从性，在基于液体活检的辅助诊断中具有重要价值［17］，外泌体亦可作为疾病治疗的药物载体及治疗靶点［18］，对于精准医疗的实施及发展具有重要的促进作用。在临床及基础科学研究中，常累积大批血清或血浆样本进行相应的外泌体检测，因此多方面评估其保存时间对于外泌体生物学特性的影响具有重要的指导意义。

血浆和血清的保存时间对其中外泌体的形态特征无大影响，但是随着保存时间延长，外泌体中的蛋白标志物TSG101和CD63含量发生降低。这提示我们进行外泌体蛋白的相关研究时最好新鲜提取外泌体立即进行下一步实验。