魏冠棉，张军伟，周 鹏*

（江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，食品安全国际合作联合实验室，江苏 无锡 214122）

腐乳在我国具有悠久的历史，它是采用天然大豆经加工发酵而成，具有风味独特、营养丰富等优点[1]。根据是否有微生物参与，腐乳可以分为腌制型腐乳和发酵型腐乳[2-3]：由于腌制型腐乳发酵周期长、产品质地粗糙、氨基酸含量低等弊端，所占比重很小；发酵型腐乳根据菌种的不同可以分为毛霉型腐乳、根霉型腐乳和细菌型腐乳[4-5]，由于毛霉具有丰富且有益的酶系，赋予了毛霉型腐乳柔糯细腻的口感，因此国内90%～95%腐乳菌种为毛霉[6-8]。目前腐乳常用的毛霉菌种有总状毛霉、雅致放射毛霉和五通桥毛霉[6,9]。3 种毛霉分布在不同的腐乳产地，目前尚鲜见对比其对腐乳的品质、微观结构和流变性质影响的研究报道。

油腐乳是云贵地区特色发酵食品。该地区特殊的地理气候条件形成了利于油腐乳发酵的独特微生物菌群，使得所生产的油腐乳品质优异而香气浓郁。与其他地区腐乳不同的是，它采用乳酸菌作为豆腐的凝固剂；在腐乳的汤料中，用菜籽油代替水，赋予了油腐乳独特的风味和丰富的脂类营养物。

本研究主要结合云贵地方特色油腐乳，采用不同毛霉菌种发酵油腐乳，并分析发酵过程中油腐乳的品质、结构和流变性质的动态变化，研究不同毛霉菌种对油腐乳的影响，以期为油腐乳的研究和生产提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油腐乳生产过程中的原辅料取自云南牟定腐乳生产企业；筛选菌种为来自实验室前期筛选保存优质毛霉菌株（Mucor racemosus MD-102），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15264；生产用雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）CICC 40701、总状毛霉（M. racemosus）CICC 40491、五通桥毛霉（M. wutungkiao）CICC 40854来源于中国工业微生物菌种保藏中心。

氢氧化钠、硫氰酸钾标、硝酸银甲醛、硫酸铁铵、硼酸、溴甲酚绿、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸、无水硫酸铜、硫酸钾、酪蛋白、盐酸、三氯乙酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；戊二醛 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

T10 basic分散机、IKA-RO10搅拌器 德国IKA仪器设备有限公司；S220 Seven Compact pH/离子计 瑞士梅特勒-托利多公司；BGZ-246电恒温烘箱 上海博迅实业有限公司；电热恒温水浴锅HWS-26 上海双旭电子有限公司；X08A自动消化装置、K1302自动定氮分析仪上海晟声自动化分析仪器有限公司；HAAKE MARSIII流变仪 美国赛默飞世尔科技公司；LSM710激光共聚焦显微镜 德国卡尔·蔡司公司；Quanta 200扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 油腐乳的制备与采集

油腐乳制备：取优质大豆浸泡后磨浆，过滤后煮浆，冷却后加入凝固剂制成豆腐，切成小块；喷洒105CFU/mL霉菌孢子悬浮液到豆腐上，28 ℃培养3 d，制得毛坯；毛坯经晾晒和盐渍，制得盐坯；加入调料至盐坯，装瓶，常温发酵3 个月，即得到油腐乳成品。

样品采集：在前发酵0 d、前发酵4 d、晾晒、盐渍、后发酵0 d、后发酵30 d和后发酵90 d时，随机收集油腐乳（筛选菌种、总状毛霉、雅致放射毛霉、五通桥毛霉）各5 瓶。

1.3.2 油腐乳理化指标的测定

水分含量：采用直接干燥法，参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》[9]；总酸含量：采用酸碱滴定法，参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[10]；氨基态氮含量：采用甲醛值法，参照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》[11]；水溶性蛋白含量：参照NY/T 1205—2006《大豆水溶性蛋白含量的测定》[12]；氯化钠含量：采用间接沉淀法，参照GB/T 12457—2008《食品中氯化钠的测定》[13]；蛋白酶活性：参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[14]。

1.3.3 油腐乳微观结构的测定

参考Peng Xingyun等[15]的方法进行扫描电子显微镜观察。将油腐乳样品切成1 mm×10 mm×10 mm的薄片，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定12 h；磷酸缓冲液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；依次采用30%、50%、70%、90%、95%和100%乙醇溶液梯度脱水，时间各为15 min；样品经二氧化碳临界点干燥，并通过离子溅射喷金；然后进行扫描电子显微镜观察，电压为12.5 kV，放大倍数为2 000 倍。

1.3.4 油腐乳涂抹性的测定

涂抹性测定参考Daubert[16]和Tárrega[17]等的实验方法。腐乳样品沥干油并去除表面的菌丝膜，用研钵研磨均匀，取约1 g样品至流变仪进行分析。采用P35 TiL平板，间隙为1 mm，剪切速率1～100 s-1，时间为300 s，每个样品在25 ℃重复3 次。

1.3.5 感官评价

油腐乳的感官评价通过形、色、香、滋、质地5 个方面制定感官评分标准[18-19]，选定15 名感官评价人员，按照表1进行评分。

表1 油腐乳感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of oil sufu

2 结果与分析

2.1 毛霉生长状况

如图1所示，经4 d培养后，筛选菌种和总状毛霉的菌丝短小、致密且洁白；雅致放射状毛霉和五通桥毛霉的菌丝相对较稀疏，但二者的菌丝较长，利于油腐乳毛坯外层菌膜的形成，即利于维持腐乳的块形。

图1 4 种毛霉菌种在PDA培养基及油腐乳白坯上培养4 d的外观Fig. 1 Appearance of four Mucor strains cultured on PDA medium and tofu for 4 days

2.2 油腐乳发酵过程中蛋白酶活性的分析

由图2可知，蛋白酶活性随发酵时间的延长呈先上升后下降的趋势，这与文献[20-21]的研究结果相一致。在前发酵过程中，霉菌不断生长繁殖并分泌和累积蛋白酶，故使得油腐乳白坯中蛋白酶活性的升高。在前发酵4 d后，雅致放射毛霉和五通桥毛霉的蛋白酶活性大于20 U/g，明显高于总状毛霉和筛选菌株（15 U/g和7.5 U/g）。经晾晒后样品中蛋白酶活性降低，可能是因为蛋白酶随着水分而流失，且水分的缺失使得霉菌分泌蛋白酶受限；与其他3 组样品不同的是筛选菌种的酶活性进一步升高，表明筛选菌在水分降低时仍可以生长和分泌蛋白酶。在盐渍和后发酵过程中，由于盐对蛋白酶的抑制作用，使得油腐乳中的蛋白酶活性进一步降低。由于筛选菌种与总状毛霉均亲缘关系较近，故二者蛋白酶的变化幅度相一致；而五通桥毛霉发酵油腐乳的蛋白酶活性在后发酵过程中呈上升趋势，表明五通桥毛霉在后发酵过程中耐高盐性优于前三者。

图2 油腐乳发酵过程中蛋白酶活性的变化Fig. 2 Change in protease activity of oil sufu during fermentation

2.3 油腐乳发酵过程中理化性质的分析

通过测定不同发酵时期腐乳的总酸、氨基态氮和水溶性蛋白等理化指标表征腐乳发酵过程的成熟度，并用以检测腐乳品质的动态变化[22-23]，结果见图3。

图3 油腐乳发酵过程中理化性质的变化Fig. 3 Changes in physicochemical properties of oil sufu during fermentation

水溶性蛋白质是腐乳中重要的风味前体物质，与腐乳品质有密切关系[23-25]。从图3可知，随着后发酵时间的延长，水溶性蛋白含量逐渐增加，且符合行业标准对成品腐乳的氨基态氮含量的要求。后发酵过程中，筛选菌种的水溶性蛋白含量最高，其余依次为总状毛霉、雅致放射毛霉和五通桥毛霉，表明了筛选菌种在油腐乳水解蛋白能力最强，这与后发酵过程中蛋白酶活性变化相一致。

氨基态氮是判断腐乳发酵程度的特性指标之一；氨基态氮含量越高，则氨基酸含量越高，腐乳的鲜味越好[23-24]。从图3可知，随着后发酵时间的延长，氨基态氮含量逐渐增加，且符合腐乳成熟标准要求。筛选菌种组氨基态氮含量增长最快，总状毛霉和雅致放射毛霉次之，五通桥毛霉组最小。该研究结果表明筛选菌种在油腐乳后发酵过程中的蛋白分解代谢优势优于其他3 种毛霉，总状毛霉和雅致放射毛霉分解代谢蛋白能力相近，五通桥毛霉代谢生成氨基态氮的能力低于其他3 种毛霉。

总酸是衡量腐乳质量的重要指标之一，同时也可以反映腐乳的发酵程度[25]。在腐乳发酵过程中，蛋白质、脂肪和碳水化合物在酶的作用下生成游离氨基酸、游离脂肪酸和有机酸，它们形成了油腐乳的酸度。从图3可知，油腐乳在后发酵过程中，总酸含量随时间延长而上升，且符合标准对成品腐乳的总酸含量的要求。在后发酵90 d时，4 组油腐乳总酸质量分数为筛选菌种（2.18%）＞总状毛霉（2.08%）＞雅致放射毛霉（2.05%）＞五通桥毛霉（1.98%），表明筛选菌种在油腐乳分解代谢生成游离氨基酸、游离脂肪酸和有机酸的优势大于其他3 种毛霉。

水分含量反映网络结构的空间大小和完整性[26-27]，这将影响油腐乳的微观结构和质构特性。由图3可知，不同毛霉发酵油腐乳在后发酵过程中水分质量分数基本相同，稳定在60%左右，表明发酵菌种与油腐乳后发酵水分含量相关性小。

盐在油腐乳发酵过程中的作用主要是赋予油腐乳咸味，降低水分含量，抑制后发酵过程中酶活性，防止过度发酵而引起质量问题，抑制毛霉等有益微生物过度生长，尤其是抑制和防止杂菌和致病菌的生长[4,28]。由图3可知，随着油腐乳后发酵时间延长，盐质量分数在10%左右并符合标准的要求。

2.4 油腐乳发酵过程中微观结构的分析

食品的微观结构与理化性质之间具有显著相关性，蛋白质水解会改变蛋白聚集状态和凝胶结构[29-31]，因此会引起腐乳微观结构的变化。此外，食品的微观结构与食品的功能性和消费者的接受度息息相关[32]。

图4 油腐乳发酵过程中微观结构的变化Fig. 4 Scanning electron microscopic images of oil sufu during fermentation

由图4可知，在前发酵0 d，4 种油腐乳内部均为孔洞大小不一的蛋白凝胶网络结构。这主要是因为霉菌被接种到豆腐白坯上，其未分泌蛋白酶以破坏蛋白的网络结构。前发酵4 d，蛋白凝胶的网络结构孔隙在一定程度上缩小，蛋白聚集体减小。这主要是由于前发酵过程中毛霉在豆腐白坯上生长繁殖并分泌蛋白酶，部分大豆蛋白经水解作用后被分解。由图4可知，雅致放射毛霉和五通桥毛霉组的微观结构变化比筛选菌种和总状毛霉组的明显，这主要是前两者的蛋白酶活性和蛋白水解程度大于后两者（图2）引起。油腐乳毛坯在晾晒与盐渍过程中经环境条件和盐的渗透作用析出大量水分，使得坯体收缩且蛋白凝胶的网络结构孔隙进一步缩小；因蛋白酶活性受到不同程度的抑制使得蛋白水解程度不同，从而使得毛坯的微观结构变化程度不同。在后发酵过程中，蛋白的聚集体被进一步降解，蛋白凝胶的网络结构更致密。由于盐对蛋白酶、微生物生长和分泌酶的抑制作用，后发酵过程中蛋白水解速率降低，油腐乳微观结构的变化变缓。筛选菌种、总状毛霉和雅致放射毛霉的酶活性相一致，故三者的微观结构类似；后发酵前期五通桥毛霉的酶活性小于前三者，故其微观结构在后发酵0～30 d时变化缓慢且仍可观察到小的蛋白聚集体，随着蛋白酶活性的增加凝胶结构变得致密；此变化与水溶性蛋白和氨基态氮含量的变化相一致。

2.5 油腐乳发酵过程中涂抹性的变化

图5 油腐乳发酵过程中涂抹性的变化Fig. 5 Changes in spreadability of oil sufu during fermentation

涂抹性是油腐乳结构的最重要组成部分之一，它很大程度上影响消费者的接受度；涂抹性可以通过屈服应力来表示，样品的屈服应力越小代表其涂抹性越好[33-34]。屈服应力是指样品发生最初流动时所需的最小剪应力[35-36]，这是液体和固体材料的物理和流变特性[37]。如图5所示，随着油腐乳后发酵时间的延长，屈服应力逐渐降低，涂抹性逐渐提高；表明随着蛋白水解程度的增大，在一定剪切速率下所需的破坏蛋白质凝胶网络结构的剪切力减小，产品变得更加柔软且涂抹性增强。在后发酵过程中4 组油腐乳屈服应力为筛选菌种（1 060.33 Pa）＞总状毛霉（866.60 Pa）＞五通桥毛霉（855.90 Pa）＞雅致放射毛霉（740.57 Pa），表明雅致放射毛霉组油腐乳涂抹性最好，其余依次为五通桥毛霉、总状毛霉和筛选菌种。

2.6 油腐乳的感官评价

图6 油腐乳的感官评价Fig. 6 Sensory evaluation of oil sufu

由图6可知，油腐乳样品的块形无较大差异，这主要是由于筛选菌种和总状毛霉的菌丝致密，可以形成良好的菌丝膜包被腐乳块；而雅致放射毛霉和五通桥毛霉菌丝虽稀疏但菌丝长，亦可以形成菌丝膜以确保油腐乳的完整块形。雅致放射毛霉和总状毛霉发酵油腐乳样品的香气略优于筛选菌种和五通桥毛霉发酵的油腐乳，这是由于前两者的酶系较为丰富。雅致放射毛霉和五通桥毛霉发酵油腐乳样品的色泽略优于另外两组，主要是由于筛选菌种和总状毛霉发酵的油腐乳在空气中放置一段时间后，表皮略微变暗，这可能是油腐乳中的还原性物质发生氧化反应所引起的。总状毛霉、雅致放射毛霉和筛选菌株组的滋味评分高于五通桥毛霉组，这主要因为品尝后者样品时舌尖有轻微的灼痛感，这可能是五通桥毛霉在代谢过程中产生了某种物质所引起的。总状毛霉、雅致放射毛霉和五通桥毛霉的质地优于筛选菌株组毛霉，与涂抹性的结果相一致，这主要因为样品的质地主要取决于样品的成分含量以及蛋白、脂肪和水分之间的相互作用，表明筛选菌株的综合代谢作用略低于其他三者，为混合发酵以提高油腐乳质地提供依据。

3 结 论

通过研究云贵地区特色发酵油腐乳在发酵过程中霉菌的表观性状、蛋白酶活性、成熟度、微观结构、涂抹性和感官性质，发现不同毛霉发酵的油腐乳成熟度、结构、流变和感官性质各有优势。综合考虑菌种发酵油腐乳的优点，后期可以围绕毛霉混合发酵油腐乳及其对生产周期的影响开展深入的研究，以期得到优化的油腐乳，为油腐乳实际生产的品质和工艺提供一定的理论依据。