余光书 林焱斌* 熊国胜 李杰辉 张寿雄 王海洋

1．厦门大学附属福州第二医院骨科，福建福州350007

2．福建中医药大学研究生院，福建福州350122

3．厦门大学医学院，福建厦门361102

骨性关节炎是一种以关节软骨退行性变为主要病理特征的慢性骨关节疾病，其发生发展是多种原因导致成骨细胞与破骨细胞失衡所引起，但发病机制还不甚清楚［1-2］。目前，大多数研究表明软骨细胞的凋亡在骨性关节炎的发生发展过程中起着重要作用，阻止或延缓软骨细胞发生凋亡是防治骨性关节炎的一条有效途径［3-4］。软骨细胞的凋亡主要有外源性通路和内源性通路，其中线粒体介导的内源性凋亡通路越来越受到关注，而凋亡蛋白酶激活因子引起半胱天冬酶瀑布式活化和细胞凋亡是目前研究的热点［5］。笔者在既往临床观察发现补肾活血中药能够有效预防膝骨性关节炎的基础上，拟从体外细胞实验研究补肾活血中药对细胞凋亡的影响，及其对Trx2信号通路的调控作用，以期为进一步研究骨性关节炎的防治机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

成年清洁型SD大鼠，体重在(180±20)g，雌雄各半，由福建医科大学实验动物中心提供(许可证号:SCXK 2016-0002)。胶原酶 II(编号:C8150)、Trx2(编 号:YT4752)、ASK1(编 号:YT0370)、Caspase3(编号:YC006)由北京市普京康利科技有限公司提供，DMEM培养基(编号:180-500)、0.25%胰蛋白酶(编号:TE2004Y)、胎牛血清(编号:TBD11HT)由北京孚博生物科技有限公司提供，PBS缓冲液(编号GT0060)由晶泰公司提供，凋亡试剂盒(编号KGA107)由南京凯基公司提供，中药颗粒由厦门大学附属福州第二医院药剂科提供。

1.2 实验步骤

1.2.1 含药血清的制备:成年SD大鼠10只，雌雄各半，体重在(180±20)g。随机分为空白血清组和含药血清组，每组5只。依据临床常用量按实验动物与人体表面积折算的等效剂量比值换算，将补骨颗粒用生理盐水加热溶解，制成1 g/mL的水溶液。空白血清组予生理盐水2 mL/kg灌胃，含药血清组予3.08 g/kg灌胃，每日1次，连续14 d，末次给药2 h后处死大鼠，并在无菌条件下腹主动脉采血5 mL，静置2 h后低温2 000 r/min，离心15 min后分离血清，于56℃恒温水浴灭活30 min，－80℃冰箱保存。

1.2.2 软骨细胞的分离与传代:将大鼠浸泡于75%的乙醇中消毒3 min，取出处死后在无菌条件下解剖出关节软骨，去尽其他组织后放入有双抗的PBS液(含青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)漂洗4～6次，然后将其放入消毒的青霉素小瓶并加入1.5 mg/mLⅡ型胶原酶溶液，在胶原酶小瓶中剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，封口于37℃水浴锅内消化30 min，期间不时用手摇瓶，弃去上悬酶液，用DMEM漂洗1～2次，吸尽上清后再加入10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃水浴锅内消化30 min后收集上悬液，如此反复3次，集中所有上悬液，1 000 r/min离心5 min，倒去上清液，沉淀用PBS液洗涤3次，用4 mL含10%FBS的DMEM完全培养液混悬细胞，剩余软骨片及絮状胶样物弃去。将分离好的软骨细胞接种于25 cm2的培养皿中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后观察细胞贴壁情况，以后每3 d更换1次培养液。待生长细胞铺满培养皿70%～80%时，通过用0.25%胰蛋白酶在37℃温育1 min将细胞从培养瓶中分离。加入完全培养基，通过3 000 r/min离心5 min收获细胞，并重悬于培养基中以除去胰蛋白酶。将细胞接种在大培养皿中，4～5 d后获得原代细胞。在随后的传代中每2 d更换培养基，经历2～5次传代的细胞用于实验。

1.2.3 流式细胞术分析细胞凋亡:取第3代软骨细胞以1×105/cm2接种于培养板中，培养72 h细胞贴壁后“饥饿”培养24 h使细胞同步化。细胞随机分组后，于A组加入空白血清、B组加入10%含药血清、C组加入20%含药血清、D组加入30%含药血清，继续培养96 h后收集细胞悬浮液，以PBS洗涤细胞2次后使用胰蛋白酶消化并收集于离心管。在4℃条件下以1 000 r/min离心5 min两次，然后转移到专用管，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明进行操作，采用BD FACScalibur流式细胞仪定量细胞凋亡，CellQuest Pro软件用于分析细胞凋亡情况。

1.2.4 电泳和蛋白质印迹分析:将收集到的细胞通过无菌PBS清洗两次后再加入适量PBS，用无菌刮刀收集细胞于1.5 mL EP管中，在冰上用含有1 mmol/L蛋白酶抑制剂苯基甲磺酰氟(PMSF)的RIPA缓冲液裂解30 min。在4℃下以12 000 r/min离心10 min，取上清用于蛋白浓度测定(BCA法)。蛋白浓度测定后根据标准曲线计算出各个样品的蛋白含量，再加入适量5×蛋白上样缓冲液，调整各个样品的最终浓度一致后将蛋白样品煮沸5 min，以12 000 r/min离心1 min后取出上清液放入EP管中，按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配制4%PAGE凝胶，上样后先用电压80 V，约30 min，待蛋白电泳至浓缩胶与分离胶交界处时改用电压120 V，约60 min。将蛋白转移至NC膜上，再将NC膜放入现配的5%的脱脂奶粉溶液(2 g脱脂奶粉溶于40 mL 1×TBST中)中室温摇床封闭2 h。洗膜后加入按稀释液1∶1000的一抗中，4℃孵育过液。洗膜后放入按稀释液1∶3000的二抗中，水平摇动，室温孵育2 h。取出NC膜，TBST洗涤3次，每次10 min。洗膜后使用ECL发光试剂化学显色后曝光并显影，使用Image J图象分析系统测定条带灰度值，Actin作为内参，取其余组与其比值进行计算。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件分析。各组间的细胞凋亡率比较采用非参数检验方法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 采用胶原酶消化法对软骨细胞进行分离并进行原代软骨细胞传代

从SD大鼠膝关节软骨组织中分离软骨细胞，并使用光学显微镜观察培养物。从培养过程中发现原代的软骨细胞增殖速度缓慢，从第10天开始软骨细胞的增殖速度才有所加快，约在第15天软骨细胞才铺满80%～90%的培养皿。在原代软骨细胞贴壁传代后软骨细胞贴壁和增殖的速率有所加快，传代至第2、3代时细胞增殖速度最快，第4代后则呈“去分化”现象，同时还发现在培养过程中梭形状细胞在逐渐增加。见图1。

图1 细胞多为梭形，少数为星形、椭圆形，符合软骨细胞形态 A:细胞未铺满;B:细胞铺满后。Fig．1 Most of the cells are fusiform，and a few are star-shaped and elliptical，which conform to the morphology of chondrocytes．A:Not covered by cells;B:Covered by cells．

2.2 使用凋亡检测试剂盒检测4组软骨细胞的凋亡，通过流式细胞术检测第5天各组的凋亡能力

检测结果显示，空白血清组的细胞凋亡率为22.80%，明显高于含药血清组(P＜0.05)，而20%含药血清组(15.91%)与30%含药血清组(17.93%)的细胞凋亡率又明显低于10%含药血清组(21.58%)，各组间的比较具有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

2.3 Western印迹法检测不同剂量补骨颗粒含药血清对软骨细胞Trx2信号通路的影响

通过条带分析可以观察到含药血清组Trx2的表达量都明显增多，以10%含药血清组的表达量最多;空白组与10%含药血清组的ASK1与Caspase3的表达量比20%与30%含药血清组多。见图3。通过与Actin内参蛋白比值的统计，可以得到如表1所示的值。

表1 与Actin内参蛋白的比值Table 1 Ratio to Actin of internal reference protein

3 讨论

图2 细胞凋亡散点图 A:圈定细胞;B:空白血清组;C:10%含药血清组;D:20%含药血清;E:30%含药血清组。Fig．2 Apoptosis scatter plot．A:Delineate cells;B:Blank serum group;C:10%drug-containing serum group;D:20%drug-containing serum group;E:30%drug-containing serum group．

图3 Western印迹图Fig．3 Western blot

膝关节软骨组织内并无血管、神经及淋巴液等供应，因此不能通过自我更新补偿丢失的细胞，而是通过增殖来维持成骨与破骨的平衡状态，但是软骨细胞的增殖分化速度较慢。笔者在培养过程中发现10 d左右才开始逐渐聚集形成软骨细胞团集落，而在培养的15 d左右才铺满80%～90%的培养皿。因此，研究如何预防软骨细胞的凋亡具有重要的意义。而软骨细胞的凋亡由多个基因参与调控，其中线粒体介导的凋亡通路主要是通过呼吸电子漏途径，引起线粒体跨膜电位降低，导致凋亡蛋白酶激活因子释放到胞浆，随之引起半胱天冬酶瀑布式活化和细胞凋亡［6］。其中硫氧还蛋白2(Trx2)是特异位于线粒体的小分子蛋白，它在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞凋亡等方面发挥着不可忽略的作用［7-8］。

补骨颗粒由骨碎补、鹿衔草、淫羊藿、党参、茯苓、三七、川牛膝、当归、川芎、女贞子、枸杞及生地等药物组成。现代药理学研究表明，骨碎补、淫羊藿、鹿衔草等补益肝肾中药可以促进成骨细胞的增殖，抑制破骨细胞的吸收，从而达到预防退行性改变的作用［9-10］。党参、茯苓等补气健脾中药可以提高抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化物的产生，增强运动能力［11］。三七、当归等活血药物可以通过调控线粒体信号通路而控制细胞的凋亡［12-13］。由上述可知，补骨颗粒通过“补肾健脾，活血化瘀”的方法可以起到促进细胞增殖与抑制细胞凋亡的功效。本课题研究过程也证实了补骨颗粒可以抑制软骨细胞凋亡的作用。

硫氧还蛋白2(Trx2)是特异位于线粒体的小分子蛋白，可以与凋亡信号调节激酶-1(ASK1)结合并抑制ASK1的活性，从而抑制凋亡前因子Caspase3所诱导的细胞凋亡［14-15］。本实验结果也表明补骨颗粒可以促进Trx 2的表达，但是浓度较低时不利于Trx2/ASK1复合物的形成。因此，10%含药血清组的Trx2与ASK1都明显高于20%与30%含药血清组，而ASK1可以激活Caspase 3的表达及其活性，所以空白血清组与10%含药血清组的Caspase 3表达量明显多于20%与30%含药血清组。笔者从流式细胞分析技术中也发现了空白血清组与10%含药血清组的细胞凋亡率高于20%与30%含药血清组。因此，笔者认为补骨颗粒含药血清可以通过调控Trx2-ASK1-caspase 3信号途径以控制软骨细胞的凋亡，但是含药血清需要达到一定合适的浓度，否则不利于Trx 2/ASK 1复合物的形成。