王停停，王 敏，张从宇

(1.安徽农业大学农学院/农业部黄淮南部小麦生物学与遗传育种实验室，安徽合肥 230036；2.安徽科技学院，安徽凤阳 233100)

诱变育种技术可以创造具有高产、优质、抗病、抗逆等单一和复合优良性状的新资源，是目前种质创新和挖掘新基因的一个重要途径[1]。60Co-γ射线是作物育种最常用的辐射源。河南省农科院于1976年利用60Co-γ射线育成小麦新品种郑六福[2]。印度于1967年利用60Co-γ射线和紫外线结合育成小麦品种SharbatiSonora[3]。在“十二五”期间，我国利用γ射线辐射育成小麦新品种4个[4]。在小麦品质性状中，蛋白质和湿面筋含量是我国小麦粉质量评价的主要指标[5]，其中高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)主要影响小麦的烘烤品质[6-8]。面粉色泽也是影响面粉品质的重要指标之一，主要受小麦中多酚氧化酶(PPO)含量影响[9]。小麦脂肪氧化酶(LOX)活性是影响小麦品质和耐贮藏特性的因素之一，LOX活性越高，面粉的色泽越白，小麦面粉的面筋筋力越强[10]；LOX活性低则脂质的氧化反应速度降低，小麦的耐贮藏性增强[11-12]。目前，对小麦辐射诱变后代的研究主要集中在表型上，有关其品质性状的研究相对较少。本试验用60Co-γ 射线辐射郑麦9023的干种子，以其M3代为研究对象，对其籽粒蛋白质含量、 湿面筋含量、 沉降值、 硬度、高分子量谷蛋白(GMP)含量、多酚氧化酶(PPO)活性和脂肪氧化酶(LOX)活性进行遗传变异分析，旨在系统研究60Co-γ辐射对小麦品质性状的诱变效果，以合理有效地利用有关变异资源，加快小麦品质育种的进程。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦品种为郑麦9023，2001年通过河南、湖北品种审定，经农业部质量监督检验测试机构品质测试，属于强筋优质小麦。2002年经国家区域试验取样测定，其粗蛋白含量14.66%，湿面筋含量33.2%，HMW-GS组分为1A(Null)/1B(7+8)/1D(2+12)[13]。

1.2 方 法

1.2.1 诱变及其后代处理方法

2011年在国家林业辐照中心(合肥)采用200 Gy辐射剂量的60Co-γ射线照射3 000粒郑麦9023干种子10 min。将辐射处理后的M1代于2011年秋单粒点播，单行区，行长1 m，行距20 cm，株距5 cm，收获每株主穗，混脱，构成M2代种子。2012年秋种植M2代种子，种植 1 000株，收获918个单株，单株脱粒计产保存。根据田间性状从M2代群体中选取籽粒产量和蛋白质含量高的单株166株，于2013年秋种植成株系，构成M3代群体。M2代与M3代的种植方法同M1代。以上试验材料均种植于安徽凤阳安徽科技学院试验田，田间管理同大田。以未处理的郑麦9023为对照。

1.2.2 品质性状测定

用瑞典波通公司的 DA7200 型近红外谷物品质分析仪测定M3代株系籽粒的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、硬度。 M3代全麦粉GMP含量测定参照Weegels等[14]和孙 辉等[15]的方法；LOX活性测定参照 Cato[16]的分光光度法；PPO活性测定参照Anderson等[17]的方法。

1.2.3 HMW-GS提取与分离

采用SDS-PAGE方法[18-19]鉴定HMW-GS组成。每份材料取1粒种子，从无胚端切取半粒，研磨，置于1.5 mL离心管中，加入50%(体积比)异丙醇500 μL。置于气浴振荡器中60 ℃振荡30 min，10 000 r·min-1离心1 min，弃上清液，反复提纯三次。向离心管中加入200 μL样品提取液(1%β-巯基乙醇，0.5 M Tris-HCl，pH为6.8，50%异丙醇)，置于气浴振荡器中60 ℃，1 h， 10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入120 μL样品缓冲液(1%β-巯基乙醇，0.5 M的Tris-HCl，pH为6.8，4%SDS，20%丙三醇和 0.002%溴酚蓝)，即可上样或4 ℃低温保存。

采用垂直板胶电泳，分离胶为10%(pH为8.5)，浓缩胶为3.75%(pH 为6.8)，电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液(pH为8.3)。以26 mA稳流电泳，指示剂出胶后1 h停止电泳。凝胶用染色剂(12.5%三氯乙酸+0.05%考马斯亮兰)染色过夜，蒸馏水脱色至背景清晰。脱色后的凝胶用凝胶成像系统对胶照相保存，用Qalityone软件进行比较、分析。以郑麦9023(Null/7+8/2+12)、中国春(Null/7+8/2+12)和淮麦20(1/7+8/2+12)[13]为对照。

1.3 数据处理

数据用SPSS统计分析，用Excel 2010作图。变异株系的确定以超过群体均值±1.96×标准差[P(|u|≥1.96σ)≤0.05]为标准。

2 结果与分析

2.1 M3代群体的品质性状

M3代群体品质性状的分布如图1～7，GMP含量和沉降值基本服从正态分布，蛋白质含量和湿面筋含量倾向于正偏态分布，硬度倾向于负偏态分布，PPO活性和LOX活性出现两个峰。由表1可知，M3代群体的蛋白质含量、湿面筋含量、LOX活性均值高于亲本，分别比亲本高 1.4%、2.9%和18.7%；其中，湿面筋含量、LOX活性大于亲本的株系占比均高于50%。M3群体的硬度、沉降值、GMP含量和PPO活性均值低于亲本，分别比亲本低2.4%、7.1%、29.0%和 19.2%。M3群体变异系数表现为硬度<湿面筋含量<蛋白质含量<沉降值

图1 蛋白质含量次数分布图

由表2可知，蛋白质含量和湿面筋含量均发生正向变异，获得变异的株系5个(3.0%)和3个(1.8%)。硬度仅发生负向变异，获得变异株系7个(4.2%)。获得沉降值正向变异株系8个 (4.8%)、负向变异株系3个。GMP含量发生正、负向变异的株系均为3个。硬度和PPO活性均获得7个(4.2%)负向变异；获得PPO活性正向变异株系3个。LOX活性获得正向变异的株系有5个(3.0%)，负向变异株系有4个(2.4%)。

图2 湿面筋含量次数分布图

图3 沉降值次数分布图

图4 硬度的次数分布图

2.2 M3代群体品质性状间的相关性

由表3可知，蛋白质含量与硬度呈极显著负相关，与湿面筋含量、沉降值、GMP含量呈极显著正相关；湿面筋含量与沉降值、GMP含量呈极显著正相关，与硬度呈显著负相关；硬度与沉降值和PPO活性呈极显著正相关；沉降值与PPO活性呈极显著正相关；GMP含量与PPO活性呈极显著负相关；PPO活性与LOX活性呈负相关，但不显著。

2.3 M3代群体的HMW-GS组成变异

以郑麦9023、中国春和淮麦20为对照，亚基按照Payne系统[20]命名，对M3代群体进行HMW-GS组成鉴定。在166个株系中，6个株系的HMW-GS组成从郑麦9023的Null/7+8/2+12变为1/7+8/2+12。图8为部分株系的SDS-PAGE电泳图片。

图5 GMP含量次数分布图

图6 PPO活性次数分布图

图7 LOX活性次数分布图

2.4 HMW-GS亚基组成变异株系筛选

由表4可知，按照强筋小麦国家标准(GB/T 17892-1999)对蛋白质含量(≥15.0%)的规定，6个HMW-GS亚基组成变异株系的蛋白质含量均高于群体均值和亲本，且均达到强筋小麦国家标准；湿面筋含量达到中强筋标准。按照弱筋小麦国家标准(GB/T17893-1999)对湿面筋含量(≤22%)和蛋白质含量(≤11.5%)的规定，变异株系中没有弱筋小麦株系。6个HMW-GS亚基组成变异株系的籽粒硬度均高于群体均值和亲本；PPO活性均高于群体均值，其中，株系163的PPO活性高于群体均值但低于亲本；株系164的LOX活性低于亲本和群体均值。

表1 M3代群体株系品质性状的统计参数Table 1 Statistical parameters of quality characters of M3 generation

表2 M3代群体变异株系筛选Table 2 Selection of mutant plants in M3 generation

表3 M3代群体品质性状间的相关系数Table 3 Correlation analysis of quality traits of M3 generation

*:P<0.05; **:P<0.01.

CK1:淮麦20; CK2:郑麦9023; CK3:中国春；161～166:变异株系。

CK1:Huaimai 20; CK2:Zhengmai 9023; CK3:CS; 161-166:Mutation 161-166.

图8 M3代HMW-GS亚基组成的SDS-PAGE电泳图

3 讨 论

60Co-γ射线一次急性照射实验材料产生的染色体畸变可影响生物机体的形态、机能、生长发育及遗传规律，但方向不可预测。Mago等[21]利用60Co-γ射线处理小麦，获得了16株感秆锈病的突变体。张跃强等[22]将新春9号和新春6号杂交当代种子进行60Co-γ射线照射，经多代单穗选择培育出早熟、优质、高产小麦新品种新春30号。张从宇等[23]利用60Co-γ射线辐射处理皖麦50，在M3代中筛选得到5个加工品质、沉降值、稳定时间和形成时间比皖麦50明显提升和优化的变异穗行。本研究对60Co-γ射线照射产生的变异株系进行品质性状鉴定，获得了包括蛋白质和湿面筋含量高、PPO活性和LOX活性低、沉降值高等性状优良的变异株系，进一步表明了60Co-γ射线诱变的广谱性和有效性。本研究采用诱变与分子标记相结合的方法，对亚基突变株系的结构和突变机理进行深入研究，其结果对提高诱变选择效率有重要参考价值，降低了诱变育种的盲目性和不确定性。

60Co-γ射线辐照对小麦后代的品质性状有显著影响[24-26]。本研究在M3代中获得了6个未曾报道过的新的变异类型，例如分别具有低PPO活性和低LOX活性的小麦变异株系。研究表明，1亚基为优势亚基，1和7+8亚基对面包烘烤品质指标具有较大的正向作用[27]，以1亚基代替N将显著改善小麦的烘烤品质[28]。本研究在M3代中获得了1亚基代替N的变异株系，具有较高的研究和育种价值。以上品质变异株系为小麦高分子量谷蛋白亚基分子机理研究和选育优异品质小麦品种提供了新的种质资源。