郑丽莉

(山东协和学院，山东 济南 250109)

心肌梗死在心血管疾病中死亡率最高，且发病年龄呈年轻化趋势[1]。治疗性血管新生成为目前心梗治疗的新途径，该方法通过药物治疗促进缺血心肌微血管形成和冠状动脉分支或侧支循环的建立，减少心肌细胞的坏死和凋亡，促进心肌修复。芎归六君子汤在《医学正传》六君子汤基础上，加味补血活血之当归、川芎组成，是治疗脾胃气虚，痰瘀内阻的常用方药。前期研究[2]显示，冠心病与脾胃具有相关性；芎归六君子汤能改善心肌梗死大鼠胃肠道功能和心脏功能，减少梗死面积；调节血管新生相关因子如VEGF、FGF、MMP、TIMP、G-CSF等，促进梗死心肌边缘微血管再生。本研究在此基础上，进一步分析芎归六君子汤对大鼠心肌边缘Akt蛋白与基因的影响，探讨芎归六君子汤促进缺血心肌微血管再生的机制是否与PI3K/Akt通路有关，为临床治疗提供客观依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD雄性大鼠60只，SPF级，体质量(200±20)g，购自济南市朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号SCXK(鲁)20140007。

1.2 实验药物

1.2.1 中药材来源

建联药店提供，山东中医药大学中药鉴定教研室鉴定。人参、白术、茯苓、炙甘草、陈皮、姜半夏、川芎、当归，按3∶3∶3∶2∶1∶2∶3∶3比例，3次煎煮混合，水浴箱60 ℃浓缩，灭菌，1 mL药液相当于0.63 g生药。

1.2.2 对照药

消心痛，国药准字H19991039，鲁南贝特制药。复方丹参滴丸，国药准字Z10950111，天津天士力公司。

1.3 实验器材

Image-Pro PlusVersion4.5.1图像分析系统；Synergy2酶标仪(Thermo multiskan ascent公司)；电泳仪(Bio-rad公司)； ABI PRISM 7000实时荧光定量PCR仪(ABI公司)。

1.4 实验试剂

小鼠抗大鼠CD34单抗(美国Santa)；SP免疫组化试剂盒(批号12108A08)；羊抗兔二抗(Jackson公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物)；实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，批号D305)；Akt，p-Akt抗体(北京博奥森生物技术公司，批号依次为bs-2056R，Thr308)。

2 实验方法

2.1 动物分组

随机分为5组，即假手术组、模型组、消心痛组、复方丹参滴丸组、芎归六君子汤组。

2.2 给药方法

假手术组、模型组、消心痛组、复方丹参滴丸组、芎归六君子汤组，每日分别灌胃盐水10 mL/kg、盐水10 mL/kg、消心痛4.2 mg/kg、复方丹参滴丸85 mg/kg、芎归六君子汤6.3 g/kg，共4周。

2.3 模型制备

大鼠麻醉，仰卧，连呼吸机，气管插管。备皮消毒，胸部第2～3肋间偏左4～5 mm处开胸，剪开心包，挤出心脏，迅速结扎冠状动脉左前降支，记录肢体II导联心电图。结扎线下心跳减弱、颜色变白，ST段弓背抬高显著，提示造模成功。假手术组穿线不结扎。术后肌注青霉素40万U，连续3 d[3]。

2.4 检测指标与方法

2.4.1 心功能测定

连续测量3个心动周期内的左室内径、室壁厚度和血流速度，计算左室内径缩短率(LVFS)、左室射血分数(LVEF)，结果为平均值。探头频率10～12 MHz[4]。

2.4.2 心肌梗死边缘区微血管密度(MVD)测定

取梗死边缘心肌，制片，SP法染色，一抗浓度1∶100。评定标准：找到心梗边缘区，400倍视野下计数，棕黄色的单个内皮细胞计数为一个血管，但管腔超过8个红细胞、带有较厚肌层的血管除外。每张切片随机计数5个视野,其均值即为该样本的MVD 值[5]。

2.4.3 Western blotting法检测梗死边缘心肌总Akt(T-Akt)、磷酸化Akt( P-Akt)蛋白的表达

标本100 mg，提总蛋白，BCA 法测定含量。取50 μg总蛋白，聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白，PVDF转膜，于1% 脱脂奶粉TBST缓冲液封闭，加一抗，4℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育，洗膜，显色，凝胶成像系统分析结果，以β-actin为内参。以P-Akt、T-Akt的条带与β-actin的光密度比值表示蛋白的表达水平。

2.4.4 实时荧光定量

RT-PCR 检测检测梗死边缘心肌Akt mRNA表达：取梗死边缘组织，TrizoL试剂盒提取总RNA，电泳鉴定RNA并定量，逆转录合成cDNA；实时荧光定量PCR仪进行反应。反应参数:95℃预变性15 min，1个循环;95℃变性10 s，60℃20 s，72℃延伸30 s，40个循环。采用相对定量2-△△Ct法比较各组Akt mRNA表达差异[6]。大鼠Akt上游引物5,-TAGGCATCCCTTCCTTACAGC-3，下游引物5,-CGCTCACGAGACAGGTGGA-3，退火温度60℃，扩增产物长度113 bps；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照，大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物5,-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3，下游引物5,-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3，退火温度60℃，扩增产物长度95 bps。

2.5 统计方法

3 实验结果

3.1 芎归六君子汤对心梗大鼠心功能的影响

与假手术组相比，模型对照组超生心动图显示LVEF、LVFS降低，说明心脏功能显著下降(P<0.01)。给药后各组显著改善，其中芎归六君子汤组效果最为显著(P<0.01)。见表1。

3.2 芎归六君子汤对大鼠心梗边缘微血管数量和密度的影响

与假手术组相比，模型对照组新生微血管数量显著增加(P<0.01)，说明心肌梗死后自发性微血管新生进行修复。各用药组微血管数量较之模型对照组显著增加(P<0.01)，且芎归六君子汤组微血管数量最多(P<0.01)。见表1。

分组LVEF(%)LVFS(%)MVC/MVD假手术组79.35±5.1548.23±3.5411.45±1.33模型对照组 42.36±3.24ΔΔ21.39±2.65ΔΔ32.57±3.52ΔΔ消心痛组56.81±4.53▲▲26.16±3.23▲▲46.51±4.57▲▲丹参滴丸组58.37±4.27▲▲28.73±2.31▲▲51.28±4.33▲▲芎归六君子汤组68.53±5.13▲▲★★●●37.56±2.57▲▲★★●73.65±5.14▲▲★★●●

注：与假手术组相比，ΔΔP<0.01；与模型对照组相比，▲▲P<0.01；与消心痛组相比，★★P<0.01；与丹参滴丸组相比，●P<0.05,●●P<0.01

3.3 芎归六君子汤对梗死边缘心肌组织Akt蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型对照组总Akt、磷酸化Akt及二者比值均显著升高(P<0.05)，说明心肌梗死后Akt蛋白表达增多。各用药组较之模型对照组显著升高，芎归六君子汤组效果显著优于消心痛组及丹参滴丸组(P<0.05)。见表2。

分组nT-AktP-AktP-Akt/T-Akt假手术组120.428 1±0.014 20.102 6±0.012 10.239 1±0.011 2模型对照组120.520 8±0.025 1Δ0.180 1±0.013 4Δ0.345 7±0.007 9Δ消心痛组120.601 7±0.015 8▲0.291 4±0.015 2▲0.484 3±0.013 5▲丹参滴丸组120.616 0±0.016 5▲0.301 6±0.015 6▲0.489 6±0.015 1▲芎归六君子汤组120.755 4±0.014 8▲▲★●0.426 9±0.014 7▲▲★●0.565 1±0.013 4▲▲★●

注：与假手术组相比，ΔP<0.05；与模型对照组相比，▲P<0.05,▲▲P<0.01；与消心痛组相比，★P<0.05；与丹参滴丸组相比，●P<0.05

3.4 芎归六君子汤对梗死边缘心肌组织Akt mRNA表达的影响

与假手术组相比，模型对照组Akt mRNA表达升高显著(P<0.01)。各给药组均有增加，其中芎归六君子汤组增加最为显著(P<0.05)。见表3。

4 讨论

心肌梗死是指在冠状血管病变基础上，冠脉的血流急剧减少或中断，使心肌长时间缺血缺氧，最终导致心肌坏死。心梗发生后，凋亡相关机制首先启动，凋亡复合体形成，多种蛋白酶被活化，进而诱导心肌细胞凋亡。急剧缺血缺氧导致肌原纤维断裂，肌丝增宽，左室进行性扩张，心功能下降。治疗性血管再生可促进冠脉侧支循环的建立和开放，为缺血心肌提供血供，减少心肌细胞的凋亡，有效改善心功能，成为心梗治疗的研究热点。

分组n△Ct△△Ct2-△△Ct假手术组122.523 3±0.009 8 0±0.009 8 1±0.006 8模型对照组12 1.458 9±0.025 3-1.064 4±0.025 32.091 7±0.036 8ΔΔ消心痛组121.282 4±0.052 6-1.241 0±0.052 62.365 0±0.085 7丹参滴丸组120.946 3±0.065 6-1.577 1±0.065 62.986 5±0.133 8▲▲★芎归六君子汤组120.573 3±0.068 9-1.950 0±0.068 93.867 8±0.186 0▲▲★★●

注：与假手术组相比，ΔΔP<0.01；与模型对照组相比，▲▲P<0.01；与消心痛组相比，★P<0.05,★★P<0.01；与丹参滴丸组相比，●P<0.05

LVEF和LVFS是反映心功能的重要指标。LVEF是指心室舒张末，每搏输出量与心室容积的比例，反映心室的收缩力和射血能力。LVFS代表左心室环形心肌的收缩能力[7]。研究显示，芎归六君子汤给药4周后，LVEF和LVFS显著提高，说明左室收缩和舒张功能以及室壁顺应性显著改善。

MVD指每个视野内微血管数量，能够较准确反映梗死心肌微血管新生的情况。CD34是高度糖基化的跨膜糖蛋白，选择性地表达于造血干/祖细胞表面，是血管生长过程中的内皮细胞表面标志物，会随着细胞的成熟逐渐减弱至消失。研究结果显示，模型组微血管数量显著高于假手术组，说明心梗后出现了自发性代偿性微血管新生，与心肌缺血缺氧、炎症反应等有关，但此种再生非常缓慢，难以形成有效的侧支循环。各给药组尤其是芎归六君子汤组微血管数量显著高于模型对照组，说明给药后，微血管数量增加，更能及时促进侧支循环形成，增加血供。

血管新生是一个高度受控的复杂的程序化的级联过程，血管内皮细胞的增殖、迁移是基础性环节，多种内皮细胞生长因子和信号通路参与其中。心肌缺血缺氧会激活PI3K/Akt 信号传导通路，即磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PKB或Rac)通路。该通路广泛存在于细胞中，在细胞生长、增殖、分化、迁移等多种生理活动发挥关键作用，其功能涉及细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡和细胞运动等诸多方面。

PI3K下游有多种效应分子，其中Akt处于通路的关键环节。许多生长因子、激素、细胞因子与其相对应的受体结合，活化脂质激酶 PI3K，并且激活 Akt，在细胞质膜中生成 PIP3。Akt与 PIP3 相结合，导致 Akt 转位至细胞膜。活化的Akt能够通过下游多个凋亡、增殖等调控因子，减少心肌细胞凋亡，促进血管新生，减轻心肌损伤。第一，Akt能促进抗凋亡蛋白Bcl-2 生成，抑制 Bax、Bad 及 caspase等促凋亡蛋白的形成，或者使 GSK-3β(糖原合成酶激酶 3β)发生磷酸化而失去诱导细胞凋亡的能力，多途径抑制细胞凋亡，发挥心肌保护作用[8]。第二，Akt可以介导血管内皮细胞的生长。VEGF和bFGF可以增加微血管的通透性，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，是参与血管新生的重要生长因子。VEGF通过整合素相关激酶(ILK)诱导Akt/PKB的磷酸化，抑制Akt/PKB蛋白降解，增加丝/苏氨酸激酶的稳定性，从而诱导内皮细胞增生和移行[9]。PI3K/Akt可以激活激酶鼠双微体基因-2 编码蛋白，促进细胞分泌 VEGF；同时，VEGF可反馈性激活PI3K/Akt通路，进一步促进血管新生[10]。bFGF与FGFRl受体结合，通过PI3K/Akt通路将信号传入细胞核内，促进调节内皮细胞生长、增殖和迁移[11]。

芎归六君子汤源于《医学正传》六君子汤加味当归、川芎而成，功能补气化痰活血，多用于治疗脾胃疾病证属气虚痰瘀者。该研究用于治疗心肌梗死，人参、白术、茯苓、甘草健脾补气，气有推动之功效，可以改善心脏功能，促进射血能力。气能生血，脾胃为气血生化之源，促进血液化生，促进微血管新生；心梗后，气血瘀滞，瘀血不去，新血不生，通过川芎、当归和半夏等活血化痰，祛除痰瘀，加之当归兼具补血活血之效，进一步促进新血生成，与本实验结果微血管新生、侧支循环建立相吻合。关于对PI3K/Akt通路的影响，说明中药可以通过多途径、多靶点对疾病进行干预，体现了中医整体论证的优势。

综合以上研究，可初步推断，芎归六君子汤促进梗死心肌血管新生的原理，可能与PI3K/Akt 信号通路激活，皮细胞增殖、分化和迁移相关。前期研究显示，芎归六君子汤能显著促进VEGF和bFGF在心肌中的蛋白和基因表达，结合本研究结果，PI3K/Akt 信号通路的激活，可能依赖于VEGF和bFGF与相应特异性受体的结合。关于VEGF和bFGF与PI3K/Akt通路的相关性，尚有待进一步实验探讨。