张惠子，黄金昶

(1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.北京中医药大学附属第三医院，北京 100029)

胰腺癌是一种发病隐匿，恶性度高，预后差，死亡率高的消化道恶性肿瘤[1]。多数患者诊断时已经是局部晚期或者发生远处转移，失去手术机会，因此吉西他滨成为治疗进展期胰腺癌的一线化疗药物，但由于存在原发或继发耐药性，其临床疗效仍较差[2]。近年来，中西医结合治疗肿瘤已成为研究热点，前期的研究已证实单用加味乌梅丸对胰腺癌移植瘤的生长有抑制作用，其抑瘤机制主要是促进肿瘤细胞的凋亡[3]。本研究旨在进一步探讨加味乌梅丸联合吉西他滨对胰腺癌移植瘤细胞凋亡的机理。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级BALB/c-nu/nu裸小鼠，雄性，5～6周龄，体质量(20±2)g，共40只，购于中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 实验材料

加味乌梅丸由乌梅50 g，当归20 g，白芍30 g，细辛3 g，干姜10 g，川椒6 g，桂枝10 g，黄连3 g，黄柏10 g，党参10 g，制附片(先煎)10 g，炒枳壳10 g，木香10 g，生黄芪30 g，壁虎(剪段)30 g组成，按《中药药理研究方法学》[4]附表“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表”计算出裸小鼠的用量，水煎成浓度为2.0 g生药/mL，高温灭菌(由中日医院煎药室完成)，4℃备用；注射用盐酸吉西他滨(泽菲)，江苏豪森药业；TUNEL试剂盒，罗氏公司。

1.3 造模与分组

人胰腺癌SW1990细胞株[5]在含10%小牛血清的PRMI1640培养液，37℃，5%CO2细胞培养箱内培养，取对数生长的6×107/mL细胞制成单细胞悬液，取0.1 mL接种于裸鼠右腋下，制备皮下移植瘤模型，成瘤率为100%。

将裸鼠按体质量随机分为4组，每组10只。从接种第2天开始模型组，灌胃生理盐水0.4 mL/只/天，共21 d；中药组，灌胃加味乌梅丸0.4 mL/只/天，共21天；化疗组，吉西他滨按100 mg/Kg，腹腔注射0.2 mL，每周1次，共2次；中药+化疗组，给药方法同中药组、化疗组。

2 方法

2.1 瘤体积及瘤质量测量

从第9天开始每4天用游标卡尺测量瘤结节的最大长径a、短径b及高c以计算瘤体积(V=πabc/6)，并绘制肿瘤生长曲线；21天后处死裸鼠，称取瘤质量，计算抑瘤率(抑瘤率=模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重/模型组平均瘤重×100%)，合并用药效应根据webb氏分数乘积法计算：(fa)1.2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2](fa)1和(fa)2分别为中药组、化疗组的抑瘤率，(fa)1.2为两组理论相加效应，如果合并用药的效应大于理论相加效应，则表示有协同抑瘤作用[6]。

2.2 TUNEL染色

(1)用二甲苯浸洗2次，每次5 min。(2)用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min。(3)用Proteinase K工作液处理组织15～30 min在37℃8 min。(4)PBS漂洗2次。(5)制备TUNEL反应混合液，处理组用50 μLTdT+450 μL标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50 μL标记的dUTP液，阳性对照组先加入100 μL DNase l，在15～25℃反应10 min，后面步骤同处理组。(6)玻片干后，加50 μLTUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μL标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中37℃反应1 h。(7)PBS漂洗3次。(8)玻片干后加50 μL converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中37℃反应30 min。(9)PBS漂洗3次。(10)在组织处加50～100 μL DAB底物，15～25℃反应10 min。(11)PBS漂洗3次。(12)拍照后再用苏木素复染。分化，自来水返蓝。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。每张切片在高倍镜下(40倍)定位，在非坏死区，随机选取10个视野，采用image pro plus图像分析软件计数凋亡细胞，判断标准[7]：散在分布，胞核或胞核和胞质同时呈棕黄色，呈典型凋亡形态特征。

2.3 细胞凋亡基因Bcl-2、Bax蛋白的表达

采用免疫组化SP法染色检测，具体操作步骤如下：(1)用二甲苯浸洗2次，每次15 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次1 min；(2)PBS漂洗2次；(3)0.3%的H2O2加盖浸洗15 min；(4)PBS浸洗3次；(5)滴加一抗：鼠抗人Bcl-2、Bax蛋白单克隆抗体稀释为1∶500，湿盒中4℃冰箱过夜；(6)PBS浸洗3次；(7)滴加二抗：兔抗鼠抗体，湿盒中37℃反应30 min；(8)PBS浸洗3次；(9)浸入DAB工作液中显色，于光学显微镜下观察；(10)Harris苏木素复染色15s；(11)自来水洗10 min；(12)梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；每张切片在高倍镜下(40倍)定位，在非坏死区，随机选取10个视野，采用image pro plus图像分析软件分析每张切片的累积光密度IOD[8]。判断标准：Bcl-2蛋白在胰腺癌肿瘤细胞中表达于胞浆、核膜等处。Bax蛋白在胰腺癌肿瘤细胞中表达于胞浆等处。阴性：细胞浆和核周无着色；阳性：细胞浆及核周着色为浅黄色或棕黄色、棕褐色。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 肿瘤生长曲线

待瘤结节形成后，测量并计算瘤体积，绘制生长曲线图。模型组及用药组移植瘤的体积随着时间的延长而明显增加，但用药组移植瘤的体积增长幅度明显小于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

图1 移植瘤生长曲线图

3.2 瘤质量及抑瘤率

中药组、化疗组和中药+化疗组各组的瘤质量均小于模型组，中药组、化疗组、中药+化疗组的抑瘤率分别为24.36%、48.59%和63.88%。大于其理论相加抑瘤率61.11%，故表明加味乌梅丸与吉西他滨联合有协同抑瘤作用(见表1)。

3.3 凋亡细胞数的结果

与模型组相比，中药组、化疗组和中药+化疗组中呈棕黄色颗粒表达的凋亡细胞数明显增多，差异均有统计学意义(P均<0.05)；其中中药+化疗组与中药组和化疗组相比，差异亦均有统计学意义(P均<0.05),表明加味乌梅丸可协同吉西他滨诱导细胞的凋亡(见表2)。

表1 各组荷瘤鼠的瘤体积和瘤质量的比较

注：与模型组比较，*P<0.05； 与化疗组比较，#P<0.05

表2 各组荷瘤鼠肿瘤组织中凋亡细胞数比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与中药+化疗组比较，#P<0.05

3.4 Bcl-2、Bax蛋白表达结果

与模型组相比，中药组、化疗组和中药+化疗组中Bcl-2蛋白表达的着色颗粒明显减少；差异均有统计学意义(P均<0.05)；其中中药+化疗组累积光密度IOD为最低。而Bax蛋白表达的着色颗粒明显增多；差异亦均有统计学意义(P均<0.05)；其中中药+化疗组与化疗组相比，差异亦有统计学意义(P<0.05)。表明加味乌梅丸协同吉西他滨诱导细胞的凋亡的机制，可能是与凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下降，凋亡促进蛋白Bax的表达增多有关。见表3，图2。

表3 各组荷瘤鼠肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达结果

注：与模型组比较，*P<0.05；与中药+化疗组比较，#P<0.05

注:A：模型组；B：用药组图2 Blc-2蛋白表达(×40)

4 讨论

黄金昶教授认为胰腺癌的病位在肝经，根据厥阴病的阴阳消长规律，此时为阴气尽而阳气始生，故胰腺癌的病机为肝阳虚，寒湿内盛。乌梅丸是治疗厥阴病的代表方，临床上采用加味乌梅丸治疗胰腺癌，主要是取乌梅性味酸平，归肝脾经，肝体阴而用阳，肝主升发，配当归、白芍以养肝阴，补肝血；厥阴肝木生于肾水而育心火，故附子补肾之阳，以助肝阳，党参益肝气；肝之阳气在生长阶段易郁而化火，故黄连、黄柏清火热之邪，且黄连配附子，一清泻一温引，邪热可尽；干姜、川椒温化中焦寒湿；细辛、黄柏合用起沉寒，清湿热；桂枝温心阳，推动阳气上升；加生黄芪补一身之气血；炒枳壳、木香行气消胀；而其中壁虎具有软坚散结、活血化瘀、抗肿瘤的功用，为治疗肿瘤的良药[9]。现代药理研究也证实了壁虎的抗肿瘤活性是通过多靶点，多水平共同实现的[10]。

本实验在前期实验基础上增加阳性对照药物吉西他滨，吉西他滨是目前治疗胰腺癌的一线化疗药物，通过实验可看出中药+化疗的联合用药组对胰腺癌移植瘤有协同抑瘤作用，这也体现了中药在配合化疗期间的增效优势。此外，实验也证实了加味乌梅丸的抑瘤作用是通过促进肿瘤细胞凋亡而实现的[3]。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，有别于坏死，是维持机体平衡的重要机制。细胞凋亡在肿瘤发生，发展以及在其产生耐药中发挥重要作用[11-12]。

然而细胞凋亡是一个多基因参与的、复杂的过程。本实验为探讨加味乌梅丸促进肿瘤细胞凋亡的机理，发现其中Bcl-2家族的表达与调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号传导途径中发挥重要作用[13]。Bcl-2家族分为抑制凋亡和促进凋亡蛋白两大类，Bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有显著抑制作用的凋亡相关基因。Bax基因抑制Bcl-2的活性，从而发挥其促进凋亡的作用，Bax和Bcl-2蛋白结构上的特点和相互作用，使二者在细胞内有着密切联系，即Bcl-2或Bax异源二聚体形成的调节是细胞凋亡调控中一个非常重要的环节。Bcl-2蛋白水平增高，可抑制细胞凋亡；而Bax蛋白水平增高，可促进细胞凋亡[14-15]。