陈丽梅，刘利华，胡宏辉，秦艺铭，周文礼，孙敬锋，郭永军

( 天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384 )

毛蚶(Scapharcasubcrenata)属双壳纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，广泛分布于中国、日本、朝鲜、韩国沿岸，在中国以辽东湾、渤海湾、莱州湾和海州湾资源尤为丰富；毛蚶的栖息环境主要是在浅海和稍有淡水流入的内湾，在潮间带和潮下带也有一定数量的分布[1]。毛蚶采捕业一直是天津的传统优势产业，在20世纪70年代中期，毛蚶产量一度超过淡水鱼等水产品，占水产品总量的35.95%，居天津市水产品产量首位[2]。近年来，为了对毛蚶自然资源进行有效补充，天津地区的毛蚶池塘养殖规模也在逐渐扩大，而季节变化和降雨常常引起池塘温度的剧烈波动，对其生长和存活造成不利影响。因此，研究温度变化对毛蚶的影响具有重要的实际应用意义。目前相关研究主要集中在温度对毛蚶生长、存活和代谢等方面的影响上，如杨玉香等[3]研究发现，毛蚶幼贝的最适生长水温为20～26 ℃；杨凤等[4]曾报道，在10、15、20、25、30 ℃温度条件下，毛蚶在10 h内排遗速率以20 ℃最高，30 ℃下4 h内全部死亡；姜祖辉等[5]研究了11、14、17 ℃条件下毛蚶耗氧率和排氨率的变化，结果表明，随着温度的升高，毛蚶的耗氧率和排氨率均逐渐增大。而关于温度对毛蚶抗氧化酶的影响尚未见报道。

温度是影响贝类生命活动的重要环境因子之一。温度变化会使机体产生应激反应，长期处于应激状态会导致机体自由基代谢紊乱、免疫防御能力下降[6]，当机体抗氧化系统不足以清除体内过多自由基时，就会对机体产生氧化损伤[7]。贝类和鱼类等其他水生动物抗氧化酶系统作用类似，其中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等酶类，在清除过量活性氧、缓解自身损害方面发挥着重要的作用[8]。笔者探讨了毛蚶鳃、外套膜和肝胰腺组织中抗氧化酶活性在温度突变条件下的变化情况，旨在为毛蚶的温度响应机制研究提供基础数据，为毛蚶的养殖与管理提供更完善的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用毛蚶采自天津汉沽大神堂海域，壳长(35.16±4.58) mm，体质量(13.49±5.73) g。暂养期间海水温度为(11±1) ℃，盐度为(28±0.5)，连续充气，日换水1次，换水量为50%，投喂球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)。暂养7 d后，选择健康、活性强、规格基本一致的个体进行试验。

1.2 试验设计

本试验设置5个温度组：11(对照组)、14、17、20、23 ℃，每个温度组设3个平行，每个平行40枚毛蚶，试验在36 cm×21 cm×11 cm的塑料槽中进行，试验开始后，将毛蚶由11 ℃直接转移至各温度组，在0、3、6、12、24、48、96 h进行取样，每个平行组随机取3枚毛蚶。

1.3 样品处理与酶活性测定

解剖毛蚶，取其鳃、外套膜和肝胰腺组织用0.9%生理盐水清洗，液氮速冻后于-80 ℃保存，待样品全部采集完成后统一测定。测定时加入9倍于其组织质量的生理盐水，冰水浴中研磨制备组织匀浆。所得的组织匀浆于4 ℃、3000 r/min离心10 min后，取上清液用生理盐水按1∶9比例稀释用于蛋白定量和抗氧化酶活性的测定。酶活性的测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行操作。

1.4 数据分析

数据以平均值±标准差的形式表示，数据分析采用SPSS 19.0统计软件进行，通过单因素方差分析和Duncan多重比较法来分析不同处理组间酶活性的差异，以P<0.05表示差异显著，并使用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 温度突变对毛蚶存活率的影响

整个试验期间，对照组(11 ℃)和14 ℃温度组毛蚶的存活率均为100%；17 ℃温度组毛蚶在第48 h开始出现死亡，随着温度的升高，毛蚶死亡率逐渐增加；20 ℃温度组毛蚶48 h存活率为75%；23 ℃温度组毛蚶48 h存活率降至50%，并于96 h时全部死亡；25 ℃温度组12 h内毛蚶全部死亡(表1)。

2.2 温度突变对毛蚶鳃组织抗氧化酶活性的影响

温度突变对毛蚶鳃组织超氧化物歧化酶的影响见图1a。对照组(11 ℃)鳃组织的超氧化物歧化酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在3 h时到达峰值，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

温度突变对毛蚶鳃组织过氧化氢酶的影响见图1b。对照组(11 ℃)鳃组织的过氧化氢酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，于3、6 h显著高于对照组(P<0.05)，并且在3 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，于3 h显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，于3 h显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，于3 h显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

温度突变对毛蚶鳃组织谷胱甘肽过氧化物酶的影响见图1c。对照组(11 ℃)鳃组织的谷胱甘肽过氧化物酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在3 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

2.3 温度突变对毛蚶外套膜组织抗氧化酶活性的影响

温度突变对毛蚶外套膜组织超氧化物歧化酶的影响见图2a。对照组(11 ℃)外套膜组织的超氧化物歧化酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并在6 h时到达峰值，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

图1 不同温度对毛蚶鳃组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响不同小写字母表示同一取样时间点间各数据存在显著差异(P<0.05)；*表示不同时间点和0 h数据存在显著差异(P<0.05).下同.

温度突变对毛蚶外套膜组织过氧化氢酶的影响见图2b。对照组(11 ℃)外套膜组织的过氧化氢酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在24 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在6 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在24 h后恢复至初始水平。

温度突变对毛蚶外套膜组织谷胱甘肽过氧化物酶的影响见图2c。对照组(11 ℃)外套膜组织的谷胱甘肽过氧化物酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在6 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

图2 不同温度对毛蚶外套膜组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

2.4 温度突变对毛蚶肝胰腺组织抗氧化酶活性的影响

温度突变对毛蚶肝胰腺组织超氧化物歧化酶的影响见图3a。对照组(11 ℃)外套膜组织的超氧化物歧化酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在6 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降趋势，3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在3 h时到达峰值，在12 h后恢复至初始水平。

温度突变对毛蚶肝胰腺组织过氧化氢酶的影响见图3b。对照组(11 ℃)肝胰腺组织的过氧化氢酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在6 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在3 h时到达峰值，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在3 h时到达峰值，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中过氧化氢酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

图3 不同温度对毛蚶肝胰腺组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

温度突变对毛蚶肝胰腺组织谷胱甘肽过氧化物酶的影响见图3c。对照组(11 ℃)肝胰腺组织的谷胱甘肽过氧化物酶活性在试验期间基本保持稳定；14 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降趋势，在3、6 h时显著高于对照组(P<0.05)，并且在6 h时到达峰值，在24 h后恢复至初始水平；17 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；20 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降的趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平；23 ℃温度组中谷胱甘肽过氧化物酶活性呈先升后降趋势，在3 h时显著高于对照组(P<0.05)，在12 h后恢复至初始水平。

3 讨 论

3.1 温度突变对毛蚶生存的影响

贝类是变温动物，温度是影响其新陈代谢的重要因子之一，温度升高能够加强生物体内的代谢，但超过一定范围会抑制其生长，甚至造成死亡。毛蚶生长的适应温度为18～28 ℃[1]，低于或高于这个范围其生长会受到影响。本研究中，11、14 ℃和17 ℃温度组毛蚶生存状况良好，20 ℃和23 ℃温度组毛蚶在48 h开始出现死亡，超过25 ℃的温度组中毛蚶12 h内全部死亡。试验结果表明，温度升高幅度越大，对毛蚶存活率的影响越明显，且死亡率随胁迫时间的延长不断上升。陈雷等[9]采用缓慢升温的方式(每日升温1～2 ℃)研究了温度对辽宁沿海毛蚶潜沙能力的影响，亦发现毛蚶在温度升至25 ℃时，12 h后未潜沙个体的生命活力已经开始明显降低。本研究和陈雷等[9]的研究均发现，毛蚶在未达到其生存的极限温度28 ℃时，已经开始表现出生命活力降低甚至死亡的现象。其原因是两个毛蚶采集地点均为北方海域，海水温度常年较低，与南方毛蚶种群在高温耐受性上存在一定的差异，导致毛蚶的生存极限温度不同[9]。此外，本研究采取温度骤升的方式，对毛蚶机体的影响更为剧烈，存活率较之其他升温方式更低。

3.2 温度突变对毛蚶抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶都是生物抗氧化系统的重要组成部分。超氧化物歧化酶可以将体内产生的氧自由基转化为过氧化氢，过氧化氢酶再将过氧化氢还原成水分子和氧分子，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的变化可以准确的反映机体内自由基的代谢情况，谷胱甘肽过氧化物酶以谷胱甘肽为底物清除过氧化氢，功能与过氧化氢酶类似，同时还可以清除脂质过氧化物。3种酶对判断机体的健康状况及抗氧化防御能力具有重要意义[10-11]。

不同温度组的试验结果表明，在高温胁迫3 h后，毛蚶3种组织中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均在17 ℃时达到最大值，过氧化氢酶活性在鳃、外套膜和肝胰腺中分别在14、17 ℃和20 ℃时达到最大值，之后下降。整体来看，3种抗氧化酶活性随温度升高基本呈先升后降的趋势。刘峰等[12]对小黄鱼(Pseudosciaenapolyactis)进行29、31、32 ℃和33 ℃ 4个温度梯度处理后，肝脏和肠道内抗氧化酶(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)活性的变化也呈先升后降的趋势，31 ℃时其酶活性最大。钱佳慧等[13]研究了华贵类栉孔扇贝(Mimachlamysnobilis)在19～31 ℃时抗氧化酶的变化趋势，发现超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均呈先升后降的趋势，分别在25、26、26 ℃达到峰值。试验结果表明，适当的高温可引起抗氧化酶活性增加，起到保护作用，但过度的高温亦可引起机体代谢紊乱，导致抗氧化酶活性下降[12]。

另外，各温度组毛蚶在温度骤升后，鳃、外套膜和肝胰腺中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性随时间增加均呈升高的趋势，并于3 h和6 h达到峰值，24 h后基本恢复为对照组水平。说明毛蚶在受到高温胁迫后，在3～6 h内发生氧化应激，抗氧化酶活性在短时间内迅速上升以清除产生的自由基，机体适应环境后，毛蚶体内自由基达到平衡状态，抗氧化酶活性恢复至正常水平。在一定程度上，抗氧化酶恢复至正常水平的时间反映了机体对环境的适应能力[14]。李晓英等[15]的研究也表明，在对青蛤(Cyclinasinensis)进行32 ℃的高温胁迫后，肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均显著升高，于3 h达到最大值，并分别在7 h和5 h后逐渐恢复至起始水平，与本研究结果类似。而在对青蛤的另外一种抗氧化酶——过氧化物酶的研究中发现，其活性在温度骤升5 h后达到最高值，之后下降，于11 h又出现第二峰值[16]。过氧化物酶与过氧化氢酶一样存在于过氧化酶酶体中，可催化过氧化氢水解，同时也可分解胺、醇、酚等细胞有害物质[17]，说明不同酶或不同物种对于温度的响应还存在一定差异。

3.3 毛蚶3种组织抗氧化酶活性的比较

双壳贝类的肝胰腺作为消化器官，内有大量的酶类[16]，是研究环境胁迫下抗氧化酶活性变化的重要代表性器官；而鳃作为离子转运和渗透调节的重要组织器官，在盐度和pH胁迫的研究中涉及较多[18-19]，在温度胁迫的研究中也具有一定的代表性[20]。贝类的外套膜作为病原及异物入侵软体部的第一道屏障，会分泌出一种硫酸性黏液物质，对病原菌和入侵异物具有抑制和杀害的作用，在贝类的防护免疫过程中也发挥着重要作用[21]。本研究选择毛蚶的肝胰腺、鳃和外套膜3种组织进行分析，结果显示，在毛蚶各组织中，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性为肝胰腺>外套膜>鳃。李晓英等[16]在对青蛤另一种抗氧化酶——过氧化物酶的研究中发现，温度骤升前后各组织过氧化物酶的活性均为肝胰腺的活力最高，其次为鳃和外套膜，与本研究结果有一定的相似性。而吴静[22]在华贵类栉孔扇贝低温胁迫研究中发现，华贵类栉孔扇贝幼贝和成贝外套膜中超氧化物歧化酶活力显著高于鳃、肝胰腺和闭壳肌；外套膜和鳃中过氧化氢酶活力显著高于闭壳肌和肝胰腺。本研究结果表明，肝胰腺是最能代表毛蚶机体抗氧化防御变化的器官，和在小黄鱼[12]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[23]等鱼类中的结论一致。鳃、肝胰腺和外套膜中的抗氧化酶活性在不同贝类中存在差异，有待于进一步研究。