多浪羊MHC-DRB3基因第二外显子序列分析

2019-07-18方翟马小龙高庆华

生物化工 2019年3期

方翟，马小龙，高庆华＊

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300）

绵羊主要组织相容性复合体，又称为绵羊淋巴细胞表面抗原，存在于20号染色体上，是由Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类区域组合而成，多态性较高。前人研究结果表明，在Ⅱ类区域的DQ和DR亚区多态性集中[1]。其第2外显子为功能区，因此MHC的研究集中在DRB3基因第2外显子上[2]。

MHC分子可作为动物抗病力的遗传标记，主要原因在于众多研究表明其多态性与家畜的抗病、易感性高度相关性[3]。MHC分子可以用来作为一个候选标记基因的抗病性，是由于它的抗原呈递和对动物的免疫调节作用，它是动物抗病育种和免疫遗传学中的活跃部分[4-5]。MHC基因的高度多态性在疾病抗性及生殖调控中发挥着十分重要的作用，因此MHC基因已成为全球免疫学家的广泛研究对象。1998年Hedrick首次利用MHC基因用检测了濒危物种的自然种群的遗传变异。其后该基因被广泛用于种群进化、自然选择、近交衰退、生存及繁殖的适应性等研究[6]。另外，MHC的多态性是一种遗传性状，家畜任一经济性状的遗传都受其控制，控制MHC遗传性状的基因可能会有某种直接或间接的联系，如能发现这种联系，就可能应用MHC的多态性来进行优良个体的选育或品种的改良。对动物MHC遗传多样性的研究，可以为畜禽遗传资源的保护和利用提供依据。

MHC基因在机体免疫系统上的重要作用，让它成为家畜抗遗传育种的研究热点。脊椎动物中MHC基因的突出特点是多态程度高而且多碱基突变。近几年来，国内与绵羊MHC-DRB3基因相关的研究陆续出现，2002年刘云芳应用PCR -RFLP方法对新疆部分绵羊品种MHC-DRB3基因的遗传多态性进行了研究[7]；尚友国（2005）分析了山东四个地方绵羊品种DRB3基因的多态性[8]；杨易等人（2006）对四川四个地方绵羊群体MHC-DRB3外显子2的多态性也进行了研究[9]；另外，吐尔孙江·努尔麦麦提对新疆部分绵羊品种MHC-DRB3基因遗传多态性研究中在和田羊的41个序列中共发现290个突变位点、在塔什库尔干羊的32个序列中共发现203个突变位点[10]，他们的结果都表明绵羊MHC-DRB3基因的多态性非常丰富。

本研究通过直接测序的方法对多浪羊的MHCDRB3基因第2外显子进行序列检测和分析，了解多浪羊DRB3基因的多态性分布情况，并期望能筛选出几个能够作为遗传标记的多态位点。为今后多浪羊MHC-DRB3基因多态性的进一步研究和多浪羊的育种提供理论以及技术上的参考加快多浪羊遗传育种的进展。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 样品

在塔里木大学动物科学学院实验站选取23只多浪羊。多浪羊颈静脉无菌采血10mL/只，肝素钠抗凝，低温保存带回实验室备用。

1.1.2 PCR引物设计

参考刘云芳等[7]的文献以及GenBank数据库绵羊MHC-DRB基因Z11520序列，利用PrimerPremier5.0和OLIGO6.0软件进行DRB3基因第二外显子的引物设计，目的片段309bp；引物是由上海生工生物技术公司合成。

PrimerDRB3-F:5′-TCCTCATTAGCCTCTCCCCA-3′

PrimerDRB3-R:5′-TGGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3′

1.1.3 主要试剂

引物、2×PCRMix、血液基因组DNA提取试剂盒，均购自天根生化科技北京有限公司；琼脂糖、2000DNAMarker、DNALoadingBuffer等。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增体系

PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系

1.2.2 PCR扩增条件

94℃预变性 4 min；94℃变性 30s、60℃复性30s、72 ℃延伸 1 min，72℃延伸 10 min，35 个循环。

将检验合格的PCR产物编号，放置于有冰袋的泡沫箱子中，密封，寄送到上海生工生物工程有限公司上海测序部，双通测序。

2 结果及分析

2.1 DNA提取结果

按照血液基因组DNA提取试剂盒的提取要求将采集到的多浪羊血样进行DNA提取，将提取物在EB中染色后在凝胶成像检测仪内检测，得到一条DNA条带，见图1。

图1 多浪羊DNA提取结果

（1-10为血液DNA提取物）

2.2 PCR扩增结果

对23个多浪羊DNA样液中的MHC-DRB3基因进行PCR扩增，扩增产物经EB染色后在凝胶成像检测仪内检测，结果得到了一条约309bp的特异性条带，见图2。

图2 多浪羊MHC-DRB3基因的PCR扩增结果

2.3 测序结果

2.3.1 DRB3基因序列比对结果

用DNAMAN6.0软件对23只多浪羊的同源性比较结果表明，23个序列之间的同源性在90%以上，见图3。

图3 DRB3基因序列检测

多浪羊DRB3基因第2外显子序列中，A、T、C、G 4种碱基的比例分别为22.5%、19%、24.1%和34.4%，GC的含量明显高于AT。包括46个突变位点，其中碱基置换22个。

4 分析与讨论

本试验利用直接测序DR技术测定23只多浪羊的DNA序列，发现46个突变位点，说明MHC-DRB3基因在多浪羊中的多态性极为丰富。这个结果可能与所检测的多浪羊的来源有关，各多浪羊来源于南将各个区域，存在地域差异。但本试验用直接测序法得到的试验结果表明，多浪羊MHC-DRB3基因的多态性极为丰富，它能够在品种水平上反映多浪羊种内的遗传差异。