柱前衍生化HPLC法分离不同聚合度的壳寡糖
2019-07-18钟碧萍吴晓青周津谢茹胜
钟碧萍，吴晓青，周津，谢茹胜
（福建生物工程职业技术学院，福建福州 350002）
壳寡糖是壳聚糖降解产物，聚合度一般为2～10。壳寡糖具有良好的水溶性和生物活性[1]，具有抗菌抑菌、调节人体免疫及抗肿瘤等功能，在食品、医药及农业领域有广阔的应用前景[2]。近年来，对壳寡糖的研究取得了很大的成绩，对壳寡糖的组分分析也是在开发应用中需要解决的问题，本研究用PMP对壳寡糖进行柱前衍生化，采用高效液相色谱法对聚合度为2～6的壳寡糖进行分析分离，建立一种能较好分离并测定壳寡糖的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
壳二糖（批号:20170312）、壳三糖（批号:20170523）、壳四糖（批号:20170523）、壳五糖（批号:20160925）、壳六糖（批号:20170523），以上对照品均购自西宝生物科技有限公司，纯度均≥98%；PMP（批号:20160921，国药化学试剂有限公司）；乙腈（色谱级，Fisher公司）；乙酸铵（分析纯，国药化学试剂有限公司）。
1.1.2 实验仪器
电子天平（BS120S，d=0.1 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司）、高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津有限公司）、数控超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 混合对照溶液制备
精密称取壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖标准品各25.0 mg于10 mL的容量瓶，加水稀释定容，配制成浓度均为2.5 mg/mL的溶液。各取1 mL混合制成浓度均为0.5 mg/mL的混标溶液。
采用半纤维素酶降解壳聚糖[3]，制备壳寡糖，用 200 mL pH 为 4的乙酸 - 乙酸钠缓冲液溶解 15 g壳聚糖，而后加入同种缓冲液溶解的10 mg/mL半纤维素酶溶液 10 mL，50 ℃水浴 12 h，得到壳寡糖样品溶液。
1.2.2 衍生化过程pH的考察
取5份100 μL的混标溶液于5 mL的离心管中，加入100 μL浓度为0.5 mol/L的PMP溶液（取0.4355 g PMP 用甲醇定容至 50 mL 容量瓶），再加入氨水30、50、80、100 、120 μL，涡旋混匀，在 80 ℃水浴中反应60 min，用N2吹干，再加入0.5 mL水，加入二氯甲烷1 mL，重复萃取3次，水相用0.22 μm的滤膜过滤，待进样分析。
1.2.3 衍生化过程PMP用量考察
取5份100 μL的混标溶液于5 mL的离心管中，分别加入浓度为0.5 mol/L的PMP溶液30、50、100、150 、200 μL，再加入氨水 50 μL，其余同。1.2.1，待进样分析。
1.2.4 色谱条件的考察
色 谱 柱:C18柱（ 岛 津，250 mm×4.5 mm，5 μm）；柱温:30 ℃；流速:0.9 mL/min；检测波长:254 nm；流动相:A 乙腈，B 乙酸铵（0.01 mol/L，pH 4.5）；进样量:10 μL；梯度洗脱，A相（乙腈）比例0～5 min为 10%，6～ 14 min为 25%，15～ 28 min为45%。
1.2.5 方法学考察
（1）线性关系考察。取1.2.1配制的混合对照品溶液，配制成不同浓度的混合对照品溶液衍生化后按1.2.4的色谱条件进样。
（2）精密度考察。取1.2.1配制的混合对照品溶液衍生化后按1.2.4的色谱条件进样，连续进样6次，再根据峰面积计算相对标准偏差（RSD）值。
（3）重复性考察。取同一浓度的样品溶液6份，同一条件衍生化进样，根据峰面积计算含量，并计算相对标准偏差（RSD）值。
2 结果与分析
2.1 衍生过程pH优化结果
实验结果见图1。当加入氨水80 μL时，壳三糖与壳五糖峰面积值最大，壳二糖、壳六糖在加入氨水50 μL时峰面积值最大，壳四糖随着氨水加入量的增大而峰面积值增大，但50 μL后增大较为缓慢，故加入氨水80 μL较为合适。
图1 不同氨水体积作用下各壳寡糖峰面积
2.2 衍生过程PMP用量结果
实验结果见图2。当PMP加入量少于100 μL时，各壳寡糖的峰面积都随着壳寡糖的加入量而增大；随着PMP加入量的继续增加，各壳寡糖的峰面积都维持在最大水平或略微有所下降，故本实验选择PMP加入量为 100 μL。
图2 不同PMP用量作用下各壳寡糖峰面积
2.3 混合标准品溶液衍生化后色谱图
5种壳寡糖标准品及壳寡糖样品溶液衍生化后的色谱图如图3、图4所示。色谱分离过程采用梯度洗脱进行优化，当乙腈比例小于15%时，色谱峰较宽且分离时间长；而当乙腈比例大于30%时，各壳寡糖不能完全分离，故采用梯度洗脱的方式，优化结果为A相比例 0～5 min为10%，6～ 14 min为 25%，15～28 min为45%，并且考察流动相醋酸铵的pH，最终确定pH为4.5，浓度为0.01 mol/L的醋酸铵溶液。
图3 5种壳寡糖标准品衍生化后色谱图
图4 壳寡糖样品溶液衍生化后色谱图
2.4 线性关系考察
按1.2.3色谱条件进行进样分析，以壳寡糖浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），对壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖进行线性回归，结果见表1，表明本实验壳二糖至壳六糖线性良好。
表1 5种壳寡糖的回归方程、相关系数
2.5 重复性实验
取同一浓度样品溶液衍生化后进样分析，记录壳二糖、壳三糖、壳六糖峰面积并换算成含量，计算RSD，结果分别为1.37%、2.01%、1.15%，表明重复性良好。
2.6 精密度考察
取1.2.1配制的混合对照品溶液衍生化进样，连续进样6次，并记录壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖的峰面积，换算成含量，计算RSD，分别为0.87%、1.26%、1.76%、0.96%，1.58%，表明精密度良好。
3 结论
随着壳寡糖越来越多的功能被开发应用，其相应的分析检测要求也在提高，本研究采用PMP对聚合度为2～6的壳寡糖进行柱前衍生化HPLC分析，建立了壳寡糖柱前衍生化HPLC分离方法。该方法在壳寡糖的组分分析和质量控制等方面有一定的研究价值。
