杨海棠，胡延岭，李 盼，刘软枝，廖先静，朱丽丽，韩华民

(郑州市农林科学研究所，河南 郑州 450005)

花生是我国重要的经济作物和油料作物，也是河南省第三大作物，种植面积仅次于玉米和小麦。河南省是我国花生种植第一大省，近年来花生种植面积占全国种植面积的23%，产量占全国花生总产的27%[1]。多年来，河南花生研究取得了长足进展，促进了花生产业发展，但随着花生生产与市场的变化，花生研究中的一些问题日益突出，例如：专用型品种比较缺乏，难以满足日趋多元化的市场需求，育种材料遗传基础有待进一步拓宽[2-4]，种质创新与育种技术研究滞后等，这些问题已成为花生发展的瓶颈。

在新品种选育中，突破性的品种往往来源于关键遗传资源的发现与利用，而这又取决于种质的遗传多样性和有利基因的频率。因而，研究花生种质资源的遗传多样性具有重要意义。对河南省不同类型花生品种(系)的遗传多样性进行分析、评价，有利于对现有种质资源有明确认识，同时也可以为花生遗传资源有效利用和花生新品种选育提供理论依据。进而可以有目的地利用种质资源，有计划地创造新材料，选育出配合力高、农艺性状优良的资源，组配强优势组合，进一步培育优良品种。

本研究利用SSR分子标记技术对河南省近年来正在推广及新选育的60个包括普通型和珍珠豆型的花生地方品种(系)进行遗传多样性研究，采用MEGA 6.0软件进行聚类分析，为有效利用花生遗传资源和为育种中合理选择亲本提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料从河南省郑州、濮阳、开封、漯河、商丘、驻马店等6个地方相关育种单位收集的60个不同植物学类型的花生品种(系)，类型及来源地详见表1，其中，分类上属于普通型花生52个，珍珠豆型花生8个。2014年5月份种植在河南郑州须水试验场，生长期按常规田间管理进行。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

苗期取花生幼叶，与干燥剂一起放入自封袋。取回的样品放在-80℃冰箱保存。运用CTAB法提取花生叶片DNA[5]，用于后续SSR分析。

1.2.2 SSR分析

根据前人的研究[6-10]，选择运用200对多态性较好的SSR引物对60份花生品种(系)的DNA进行扩增。PCR扩增结果运用ABI 3500XL设备进行高通量电泳分析，并将电泳结果根据特征条带的分子量大小通过Genographer 2.1软件转化为模拟条带，详细的操作按照软件使用说明进行。

1.3 数据统计

运用R语言程序包R 3.1.2对特征条带进行遗传距离的转化。运用R软件计算AMOVA遗传距离，并运用MEGA 6.0软件中phylogeny下的UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)进行聚类分析[11]。

2 结果与分析

2.1 标记在品种间的多态性情况

200对SSR引物在60份花生品种(系)的扩增结果表明，扩增结果为单一条带的引物为98对，占总引物数的49%；扩增结果为两条带的引物为85对，占总引物数的42.5%；扩增结果为三条带的引物为17对，占总引物数的8.5%。全部200对SSR引物在60份花生品种(系)中有较好的扩增效果，均有不同程度的多态性产生，没有扩增结果完全相同的引物出现。

2.2 品种间的相似性

根据SSR标记数据计算60个品种(系)间的遗传相似系数在0到1之间(见表2)，平均值为0.3。其中，开19-2与商花10号和开农012相似系数为1，遗传相似系数最大，相似性高。此外，有30个组合的遗传相似系数达到0.9，分别为：远杂9807与开农49、郑农花12号、漯花4087、漯花4016、1004新品系、豫花9331和豫花9925遗传相似系数为0.9。商研9958与商花5号和豫花9719遗传相似系数为0.9。漯花4016与开农49、郑农花12号、豫花9331和豫花9925遗传相似系数为0.9。豫花9331与濮花33和豫花9925 遗传相似系数为0.9。濮花28与开17-60和商研9958遗传相似系数为0.9。开17-70与开农0306和郑农花12号遗传相似系数为0.9。驻花1号与濮花33遗传相似系数为0.9。豫花9327与郑农花12号和豫花9925遗传相似系数为0.9。豫花9925与漯花4087遗传相似系数为0.9。郑农花13号与开农064遗传相似系数为0.9。商花5号与豫花25号和豫花9719 遗传相似系数为0.9。豫航花3号与豫花9840遗传相似系数为0.9。商研9558 与开17-60遗传相似系数为0.9。濮花39与金果1号遗传相似系数为0.9。说明这些品种(系)间也具有较高的相似性。

遗传相似系数为0的组合有374个。分别为：开农012 与其他44个材料间遗传相似系数为0。开19-2与其他40个材料间遗传相似系数为0。商花10号与其他40个材料间遗传相似系数为0。濮花3号与其他37个材料间遗传相似系数为0。商花511与其他34个材料间遗传相似系数为0。商花8号与其他34个材料间遗传相似系数为0。郑花6号与其他32个材料间遗传相似系数为0。郑农花15号与其他22个材料间遗传相似系数为0。远杂9102与其他21个材料间遗传相似系数为0。濮花41与其他17个材料间遗传相似系数为0。0628-4与其他15个材料间遗传相似系数为0。豫花9326与其他14个材料间遗传相似系数为0。豫花15号与其他10个材料间遗传相似系数为0。在实验分析的1770个关系组合中，有616个遗传相似系数大于0.5，说明这些品种(系)间具有较低的遗传相似性。

表2 60个花生品种(系)间的遗传相似系数

表2 60个花生品种(系)间的遗传相似系数 (续表)

图 1 各个品种(系)SSR标记聚类图 Fig. 1 Cluster analysis of peanut genotypes from SSR markers

2.3 聚类分析

图1可看出，在距离320处，60份花生品种(系)被分成了5大类群，其中第一大类群又分为两大亚类，亚类I和亚类II各包含16个品种，亚类I中，包含有郑州7个，分别为：郑农花 12号、豫花22号、远杂9805、郑农花9号、豫花9925、豫花23号和豫花9327；濮阳2个，分别为：濮花33 和圣濮花1号；开封4个，分别为：开农07-24，开农0306，开17-60和开农49；漯河3个，分别为：漯花4087，漯花1号和漯花8号。亚类II中，包含有郑州9个，分别为：远杂9847、郑农花13号、豫花25号、黑花生1101、金果1号、郑农花14号、远杂9102、豫航花1号和豫花9830；濮阳3个，分别为：濮花35、濮花40和濮东花1号；开封1个，为开农064；商丘2个，分别为：商花6号和商花5号；驻马店1个，为驻花2号。第二大类群包含8个品种，其中郑州5个，分别为：远杂9807、1004新品系、豫花9719、豫花9840和豫航花3号；开封1个，为开农004；漯河1个，为漯花4016；商丘1个，为商研9958。第三大类群包含8个品种，其中郑州2个，分别为郑农花7号和豫花聚类获得的五大类群中，第一类群品种最多，为32个，第四类群品种最少，为3个。郑州育成的品种(系)在五类中均有出现。开封育成的品种(系)在四大类群出现，且第一类的I、II亚类中都有。商丘育成的品种(系)也分别出现在四大类群中，但在第一类群中，仅出现在第II亚类中。来源于濮阳的品种(系)出现在三大类群中，但第一类群的I、II亚类都有。来源于漯河的品种(系)，出现在三大类群中，但在第一类群中，仅出现在第I亚类中。来源于驻马店的品种(系)，仅出现在两大类群中，且第一类群仅在第II亚类中出现。

3 讨 论

本研究选用河南省郑州、濮阳、开封、漯河、商丘、驻马店等6个地方相关育种单位选育的近年来正在推广种植或正在培育的60个花生品种(系)进行SSR标记分析，遗传相似系数分析表明，平均值为0.3，在实验分析的1770个关系组合中，仅有616个组合的遗传相似系数大于0.5，说明这60个品种(系)整体遗传背景差异较大，这与前人研究表明的花生资源遗传基础较窄[2-4]有一定差异。可能的原因为：一是本研究选用的材料多数是不同育种单位近年来收集或者培育的材料，由于目前不同育种单位加强种质交流的力度较大，甚至有国外不同类型资源的引入与驯化，以及新种质创制的手段也多样化，例如理化诱变、远缘杂交等手段的使用，使得新的花生品种(系)有相对较宽的遗传基础[7-10]。

二是由于本研究选用的SSR引物为前人研究[12]已经证明有较好多态性的引物，对不同品种(系)的区分较为明显。遗传相似系数分析结果也表明，开19-2与商花10号和开农012相似系数为1，具有较高的相似性。此外，还有30个组合的遗传相似系数达到0.9，因而，在创造新材料，组配杂交组合时，可以结合具体的农艺性状。参考上述结论，应尽量回避在遗传相似系数高的组合中进一步组配选育新材料。

在374个遗传相似系数为0的组合中，开农012、开19-2和商花10号与其他品种(系)的相似系数则较普遍较低，而这三个品种(系)间却具有极高的遗传相似性，说明这三个品种的遗传背景比较独特，可能其祖先为共有亲本，但与其他资源材料又存在较大差异。在后期新杂交组合选配及资源利用中，应充分考虑这三个品种的特性，与其他资源组配合适的组合，培育新的优异品种。

聚类分析将60个品种(系)分成了5大类群，这五大类群中，均含有来源于郑州的品种。不同地方的品种对五大类群的覆盖度依次为开封、商丘、濮阳、漯河、驻马店。来源于驻马店的品种仅在第一大类群的第II亚类和第三大类群中出现。这种现象与本研究选用的材料数量有关，郑州为28个，开封、濮阳分别为9个，商丘为7个，漯河为5个，驻马店为2个。也与不同地方的花生育种科研人员的数量与科研实力有关，不同地方有一定的差异。在第四类群仅有的三个品种中，商丘的品种占了两个，郑州占一个。濮阳的9个品种中，在第二类群和第四类群中没有出现。这些也表明不同的育种单位在培育品种的时候亲本来源途径不尽相同，各有特色。

聚类得到的结果与遗传相似系数分析的结果有一定的相似性，例如，远杂9807与漯花4016遗传相似系数为0.9，聚类图上也距离最近。郑农花12号、漯花4087、豫花9925和开农49遗传相似系数为0.9，聚类同在第一类群第I亚类。豫花9840与豫航花3号遗传相似系数为0.9，聚类图上也距离最近。开19-2与开农012遗传相似系数为1，聚类图上也距离最近。

SSR标记是区分不同花生品种的重要手段[13-22]。在本研究中，所用的多态性较好的200对SSR引物，能够基本反映供试品种的多态性。此外，SSR标记TC3A12在郑农花13号与远杂9847和豫花9830这三个品种的扩增产物带型相同，而这三个品种均为高油品种，已有研究也表明此标记与一个高油的QTL位点紧密连锁，且该QTL对花生油分含量的遗传贡献率为2.89%[23]，这也为新品种利用和高油分含量的分子标记辅助选择育种提供了参考,但这一位点更广泛的验证工作还有待进一步开展。而基于这些多态性SSR标记开展的遗传多样性分析，对60个河南省地方花生品种的遗传多样性水平有了详细的了解。在育种工作中，可以结合农艺性状，利用亲缘关系较远、遗传差异大的材料作亲本选育优良品种。