何一旻, 顾鸣敏

(上海交通大学医学院医学遗传学实验室, 上海 200025)

肌球蛋白超家族(myosin superfamily)是一类高度保守且广泛存在于真核细胞中的家族蛋白，通过水解三磷酸腺苷(ATP)，将化学能转化为机械能，在胞质流动、物质运输和肌肉收缩等多种生理活动中发挥重要的作用。在该蛋白家族中, 肌球蛋白II类是横纹肌、平滑肌和非肌细胞中肌丝的重要组成成分[1]。肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)是肌球蛋白II类分子的关键亚基。迄今为止，在哺乳动物中已发现约13种MyHC亚型，分别由MYH家族基因不同成员编码。其中，编码骨骼肌MyHC亚型的有6种，MYH13基因为其中之一[2]。

小鼠Myh13基因定位于第11号染色体，由39个外显子组成, 开放阅读框全长5 817 bp，编码产物为MyHC-eo亚型, 由1933个氨基酸组成。MyHC-eo蛋白序列在不同种属之间高度保守，经比对，小鼠的MyHC-eo蛋白序列与人MyHC-eo蛋白序列相似度约为96%。在生理状态下, MyHC-eo与其他MyHC亚型一样，由2条MyHC和2对不同的轻链组成一个完整的肌球蛋白分子。MyHC蛋白包含2个关键的结构域： N端的头部结构域，含肌动蛋白和ATP结合位点，即所谓的横桥; C端的杆状结构域，参与粗肌丝的形成[3]。

在人类中，MyHC-eo特异性高表达于眼外肌(extraocular muscle, EOM)纤维中[4]，为一类具有超高速率、低张力、耐疲劳特点的肌纤维[5]。体外研究[6]结果表明, 在横桥周期动态变化过程中, 与其他骨骼肌中的MyHC IIa、MyHC IIb和MyHC IIx亚型相比, MyHC-eo结合肌动蛋白后与二磷酸腺苷(ADP)的亲和力最低，与肌动蛋白的结合和解离速率最快，横桥周期最短，导致肌肉收缩超快。然而，迄今为止，仍缺乏解释MyHC-eo与眼外肌超高速率、低张力、耐疲劳特点相关的体内实验依据，更不清楚MYH13在眼外肌纤维中所发挥的生物学作用。

本研究首先分析了Myh13在小鼠中的表达情况，证明在小鼠中Myh13同样特异性高表达于眼外肌中。随后，对Myh13敲除小鼠进行表型初步分析。结果显示，Myh13的敲除对小鼠的生长发育、基础代谢等没有明显影响，但会引起小鼠眼外肌纤维微观结构的改变，为后续研究MYH13在眼外肌中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的Myh13敲除小鼠，该工作由上海南方模式生物科技有限公司完成，所用小鼠品系为C57BL/6J[SCXK(沪)2017-0010]。所得小鼠后续均饲养于SPF环境中，该环境维持恒温(21～22 ℃)恒湿(55%～65%)，光照明暗交替12 h/d[SYXK(沪)2017-0012]。

1.2 主要仪器与试剂

基因组DNA抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶、动物组织总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒Quantscript RT试剂盒、qPCR试剂盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)均购自天根生化科技有限公司; 引物由金唯智生物科技有限公司合成; 蛋白抽提试剂RIPA裂解液(强)和蛋白酶抑制剂Cocktail购自翊圣生物科技有限公司; MyHC-eo抗体由上海友科生物科技公司制备; GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗均购自美国Proteintech公司; ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。实时荧光定量PCR分析仪ABI 7500 购自美国Biosystems公司; Western blotting 专用电泳槽、转膜槽和变压器购自美国Bio-Rad 公司; 化学发光信号检测仪Lumi-Phos购自美国Thermo Fisher公司; 梯度PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司; 轮转式石蜡切片机和光学显微镜购自日本Olympus公司; 透射电子显微镜超薄样本切片机购自德国Leica公司; 透射电子显微镜购自日本Hitachi公司。

1.3 Myh13在不同组织中的表达情况

取8周龄的野生型C57BL/6J小鼠(WT)，分别取眼球、肝脏、肾脏、脾脏、胃、肠、睾丸等14种器官和血液，以及眼外肌、咀嚼肌、膈肌、腹直肌等8种不同部位肌组织，分别使用RNA提取试剂盒提取总RNA，利用反转录试剂盒反转录成cDNA，利用引物Myh13-F和Myh13-R(引物序列见表1)，以Gapdh(引物见表1)为内参基因，采用qRT-PCR检测Myh13 mRNA在小鼠各组织中的表达情况。同时提取各组织的蛋白成分，采用Western blotting法检测MyHC-eo蛋白在小鼠各组织中的表达情况。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 gRNA设计

gRNA靶基因设计原则： ①靶序列20 bp后含NGG模式的PAM序列; ②靶序列在基因组水平具有高度唯一性, 以避免脱靶效应。后利用网站(http：//crispr.mit.edu)设计 gRNA，用于CRISPR/Cas9构建Myh13敲除小鼠。经筛选，选择两条分别在Myh13的第2外显子上游和第3外显子下游的gRNA，序列和位置分别为：

gDNA1(1670-1692)： 5'-CTAGAATCAGGTTAACCAAGGGG -3';

gDNA2(2317-2339)： 5'-AGTAGCAGCCAGCATGAACTTGG-3'。

1.5 Myh13敲除小鼠基因型鉴定

小鼠3周龄时，提取鼠尾基因组DNA。对于F0代小鼠使用引物P1和P2(引物序列见表1)进行PCR扩增，P1和P2分别位于敲除片段前后。PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序以筛选Myh13移码突变的小鼠。对后续子代小鼠使用引物对P3和P4、P5和P6分别进行PCR扩增(引物序列见表1)。P3是位于靶基因敲除片段上游的正向引物，P4是敲除片段中的反向引物。P5同样是位于靶基因敲除片段上游的正向引物，P6是敲除片段下游的反向引物。反应体系：10 μL Taq DNA聚合酶、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、1 μL DNA模板、8 μL去离子水。反应条件： 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物进行质量分数1%琼脂糖凝胶电泳。

1.6 qRT-PCR验证

选取8周龄的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠，根据Stuelsatz等[7]描述的方法分离眼外肌组织，提取组织总RNA, 反转成cDNA, 以Gapdh为内参，利用引物Myh13-F和Myh13-R(引物序列见表1), 根据试剂盒SuperReal PreMix Plus要求，采用qRT-PCR法检测各基因型小鼠眼外肌中Myh13 mRNA的表达情况。反应体系如下： 10 μL SuperReal PreMix、1 μL cDNA模板、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物和8 μL无核酸酶去离子水。定量PCR反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸32 s，40 个循环；72 ℃ 10 min。结果采用2-△△Ct法分析。

1.7 Western blotting验证

选取8周龄的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠，使用含有蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA强裂解液提取3种基因型小鼠眼外肌中的蛋白，并用BCA定量试剂盒检测蛋白浓度，随后加入5×上样缓冲液，100℃沸水中煮15 min, 使蛋白充分变性。随后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，再转膜至硝酸纤维素(NC)膜, 含质量分数5%奶粉的封闭液室温封闭1 h, 加入一抗(MyHC-eo抗体或GAPDH抗体) 4 ℃孵育过夜，TBST洗3次,加入HRP标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h, TBST洗3次。最后，经ECL显影液在化学发光仪中显影成像，分析MyHC-eo蛋白的表达情况。

1.8 Myh13敲除小鼠繁殖情况

统计Myh13+/-小鼠自交繁育的子代3种基因型小鼠存活的个体数量, 分析各基因型WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠数量是否符合1∶2∶1的比例，进行孟德尔遗传分析; 统计子代中不同基因型小鼠中各性别的数量; 分析出生性别比例是否存在偏差。

1.9 Myh13敲除小鼠体质量监测和血生化检测

取WT、Myh13+/-和Myh13-/-雄鼠各10只，雌鼠各10只，正常饮食喂养，在4～12周龄期间每周称量一次小鼠体质量，并做体质量变化曲线图。取8周龄雄性WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各6只,空腹12h后, 摘取眼球血, 室温静置30 min, 离心收集血清，采用希森美康(Sysmex) BX3010检测血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)。

1.10 Myh13敲除小鼠眼外肌H&E染色

选取8周龄的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各3只, 提取眼外肌组织, 用PBS清洗后于质量分数4%多聚甲醛溶液中固定24 h, 低浓度至高浓度乙醇脱水, 二甲苯处理后石蜡包埋, 采用轮转式切片机切片。对切片进行HE染色, 用中性树胶封固, 于显微镜下观察各基因型小鼠眼外肌病理学形态，并采用CellSens Entry图像分析软件测量高倍镜下眼外肌眶层(orbital layer)和球层(global layer)肌纤维横截面积。

1.11 Myh13敲除小鼠眼外肌透射电镜观察

在无菌条件下取8周龄的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各3只，提取眼外肌组织，后立即置于质量分数为2.5%戊二醛中固定24 h, 随后取出组织块, 用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗后，10 mg/L锇酸固定1.5 h，经生理盐水彻底冲洗干净后进行乙醇梯度脱水，再转入丙酮中，包埋，制作超薄切片，饱和醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，于透射电子显微镜下观察。

1.12 统计分析

使用SPSS Statistics 17.0软件进行数据分析。结果采用χ2检验(Chi-square test)或单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中Myh13的表达水平

结果表明，Myh13特异性高表达于眼外肌中,而在眼球、肝脏、肾脏、脾脏和胃等各个器官中未检测到表达(图1A和1B)，在咀嚼肌和腹直肌等其他肌肉组织中也未检测到表达(图1C和1D)。

2.2 Myh13敲除小鼠DNA、RNA和蛋白水平验证

图1 小鼠Myh13在不同组织中的表达水平Figure 1 Expression of Myh13 in different tissues of mice

Myh13敲除小鼠中，纯合移码突变的F0代小鼠原始测序序列为： CGTCCCTTGACTTTAGC——ATGAACTTGGGAGC，与WT小鼠序列比对，删除769bp。子代小鼠的基因型鉴定显示, 在WT小鼠中, 仅扩增出361 bp未敲除的基因片段; Myh13-/-小鼠中, 仅扩增出270 bp的切除后基因片段。在Myh13+/-小鼠中, 均可见上述两个位置的条带(图2A)。与WT相比，Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13 mRNA表达减少，Myh13-/-小鼠眼外肌中Myh13 mRNA不表达(图2B)。并且，Myh13+/-小鼠眼外肌中，MyHC-eo蛋白表达下降，Myh13-/-小鼠眼外肌中几乎检测不到MyHC-eo蛋白的表达(图2C)。以上结果表明，Myh13敲除小鼠中该基因成功剔除，可用于后续分析。

2.3 Myh13敲除小鼠繁殖情况

结果表明, 杂合子小鼠的子代中WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠占总体比例分别为23.9%、50.5%和25.7%，接近1∶2∶1，符合孟德尔遗传规律，说明Myh13的敲除并不会影响胚胎发育，也不会导致胚胎致死的现象发生(表2)。各个基因型小鼠的性别比接近1∶1, 无明显的性别偏移现象(表3)。

2.4 Myh13敲除小鼠体质量及血清生化检测

WT、Myh13+/-和Myh13-/-三种基因型小鼠体质量变化曲线图显示，雌性小鼠和雄性小鼠的体质量在不同基因型之间差异无统计学意义(图3)。同时，也未检测到8周龄小鼠的空腹血糖、血脂等血清生化指标存在明显异常(表4)。上述结果提示，Myh13基因敲除对于小鼠的基础代谢、肝功能、肾功能和心脏功能均没有明显影响。

2.5 Myh13敲除小鼠眼外肌H&E染色分析及电子显微镜观察

光镜下，Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的眼外肌中未见明显的病理改变，无结缔组织或脂肪组织增加的现象, 也无炎症或肌肉萎缩的现象(图4A)。经计数, WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠眼外肌眶层肌纤维数量分别为(526±49)条、(515±44)条和(519±50)条; 眼外肌球层肌纤维数量分别为(348±29)条、(339±43)条和(356±36)条; 眼外肌眶层横截面积分别为(183.04 ±23.15) μm2、(187.10 ±25.76)μm2和(179.67±23.36) μm2; 眼外肌球层横截面积分别为(374.34 ± 38.00) μm2、 (390.51 ± 35.41) μm2和(387.91±34.87) μm2, 差异均无统计学意义(P＞0.05)。电子显微镜下，三种基因型小鼠眼外肌纤维的细胞膜完整，肌原纤维排列整齐，肌节结构清晰，线粒体和细胞核正常。但与WT小鼠相比，Myh13+/-眼外肌中可见散在脂滴沉积，Myh13-/-可同时观察到散在脂滴沉积和肌质网扩张的现象(图4B)。由此提示，Myh13的敲除对小鼠的眼外肌虽然并不会引起光学显微镜下的病理变化，但是会影响肌纤维内部的超微观结构，可能会对小鼠的眼外肌功能产生影响。

图2 Myh13敲除小鼠的基因型鉴定及其眼外肌中Myh13的表达水平Figure 2 Genotype identification of Myh13 knockout mouse and the expression of Myh13 gene in extraocular muscles

表2 杂合子小鼠自交产生的子代各基因型数量Table 2 Genotypic ratio in the offsprings from the self-cross of heterozygotes

表3 子代3种基因型小鼠的性别比Table 3 Analysis of sex ratio in three genotypes of offsprings

图3 三种基因型雄鼠和雌鼠的体质量比较Figure 3 Comparison of body weight among three genotypes of male and female mice

表4 三种基因型小鼠血清生化检测Table 4 Serum biochemical analysis in three genotypes of mice

图4 三种基因型小鼠眼外肌HE染色和电镜观察Figure 4 HE staining and electron microscopic observation for extraocular muscles from mice with three genotypes

3 讨论

人类MYH13定位于17p13.1，与MYH1、MYH2、MYH3、MYH4和MYH8相邻。但是，MYH13与位于同一基因簇的其他MYH有两点不同：MYH13的全长约为64 kb, 是其他MYH基因的2倍;MYH13中外显子的分布和其他MYH中外显子的分布没有相似性[8]。然而，该基因所发挥的生物学功能与MYH家族其他成员相比有何特殊性尚不清楚，并且，MYH13与眼外肌超高速率、低张力、耐疲劳特点的相关性尚不明确。

本研究中，在WT小鼠中检测了Myh13在不同组织中的表达水平，小鼠中Myh13特异性高表达于眼外肌中，与该基因在人类各个组织中的表达谱一致。经验证， Myh13敲除小鼠的目的基因发生移码突变，实现了基因组水平的基因剔除。进一步验证发现，Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13表达减少，Myh13-/-小鼠眼外肌中Myh13不表达。至此说明, 可利用该Myh13敲除小鼠研究人类MYH13的生物学功能。

与MYH家族相关的整体动物研究[9]表明，MYH多个成员的突变与人类疾病密切相关, 例如，MYH6和MYH7的突变与人类多种心肌疾病相关。在人类中, MYH6和MYH7分别在心房肌纤维和心室肌纤维中表达，而在啮齿类动物如小鼠中, 心房肌纤维和心室肌纤维均表达Myh6。Myh6 p.R403Q突变的杂合子小鼠在出生12～25周出现心肌纤维化、肌节异常和心功能异常的表型，敲除心肌Myh6也同样可以使小鼠发生严重的心肌疾病[10]，而Myh6纯合突变的小鼠呈现胚胎致死[11]。MYH9相关性疾病(MYH9-related disease, MYH9-RD)是一类由MYH9突变引起的遗传性血小板减少症, 有时突变还可引起非血液系统的症状如肾小球肾炎、神经性耳聋和白内障等[12]。Myh9敲除小鼠模型显示, Myh9+/-并没有出现与人类类似的MYH9-RD的症状, 而Myh9+/-小鼠呈现胚胎致死[13]。Zhang等[14]建立了3种Myh9突变(p.R702C、p.D1424N和p.E1841K)敲入小鼠模型, 发现p.D1424N和p.E1841K突变的纯合子小鼠和三种突变的杂合子小鼠均出现血小板减少的症状，而p.R702C纯合突变小鼠出现胚胎致死。迄今尚无文献报道与MYH13相关的动物模型，故本研究是首次对Myh13敲除小鼠进行表型分析。

在表型分析中，本研究发现Myh13的敲除不会导致小鼠发生胚胎致死的现象，对小鼠的体质量、基础代谢等也没有明显影响，说明Myh13在小鼠的胚胎发育、生长发育等过程中并不是一个至关重要的基因。Altick等[15]和田亮等[16]均发现斜视患者的眼外肌中MYH13表达显著减少。HE染色的结果提示，斜视患者的眼外肌纤维横截面积减少，数量减少、排列紊乱、结缔组织增加等[17]。本研究对Myh13敲除小鼠的眼外肌也进行了观察, HE染色结果显示, 与WT小鼠相比, Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的眼外肌横截面积和肌纤维数量没有明显变化，且未见明显病理改变；电子显微镜观察显示，敲除Myh13后，小鼠眼外肌中可见散在肌质网扩张和脂滴沉积的现象。以往研究[18,19]表明，在先天性肌病和肌肉萎缩小鼠模型的骨骼肌组织中，也可见肌质网扩张和脂滴沉积。本研究表明，在小鼠中，Myh13的敲除可导致眼外肌微观结构改变，这一改变是否对眼外肌功能、眼球运动等产生影响，有待进一步探讨。