唐桃霞，王致和，张秀华，周彦芳，谢忠清

（甘肃省农业工程技术研究院，甘肃武威733006）

0 引言

甜叶菊（Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl.）是菊科甜叶菊属多年生草本植物，又名甜草、甜菊，原产于巴拉圭、巴西等国家[1]。甜叶菊含有14种微量元素，32种营养成分，具有丰富的营养价值，其最为重要的次生代谢产物——甜菊糖苷（Steviol glycosides），是作为甜叶菊主要提取物的新型天然甜味剂[2-3]，其中蛇菊苷（Stevioside，STV）和莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，RA）为含量最高的两个组分，RA的含量仅次于STV，甜度极高，约为蔗糖的300倍，其甜味最接近蔗糖，比STV的甜味更为甘醇，涩味少[4]，市场前景广阔[5]。有效评价甜叶菊种质是选育高产、高RA含量甜叶菊品种的前提条件。影响甜叶菊品种优劣的因素众多，如果仅凭单个性状来评价而忽略其它因素，在一定程度上割裂了各性状对品质的综合影响，则有失全面性[6]，而灰色关联度评价能够综合考虑诸多因素，对品种的评价更加客观、合理[7]，在其他作物上已有应用[8-10]，而在甜叶菊种质资源综合评价方面目前还存在空白。因此，本文以7份甜叶菊材料为研究对象，利用灰色关联度分析法对其产量和品质等性状进行综合评价，旨在客观、全面地评价甜叶菊种质，为甜叶菊新品种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试7份甜叶菊种质材料是从国内各地引进的甜叶菊优良品种的母根扦插苗，分别为GT-1、GY-23、GY-24、GY-25、GY-26、GY-27、GY-28，将以上7份材料用代号 X1、X2、…、X7表示。

1.2 试验设计

试验地位于甘肃省武威市凉州区黄羊镇甘肃省农业工程技术研究院试验基地（103°05′E，37°30′N），海拔1 740 m，属大陆性干旱气候，年平均气温7.7℃，年平均降雨量194.75 mm，年均日照时数2 724.8 h，无霜期150 d左右。供试土壤为砂壤土，肥力均匀。将从各地引入的不同品种的母根移栽至温室，于2018年3月30日剪取插穗扦插，扦插苗长至2018年5月16日，移栽至铺有黑色地膜的试验小区，试验采用随机区组设计，小区面积60 m2，每膜4行，重复3次，株距约0.2 m，行距约0.4 m，保苗约12 000株/hm2。于9月6日取样测产。

1.3 测定项目及方法

采收期对小区中间行植株进行产量测定及农艺性状考察，考察的农艺性状包括株高（K1）、主茎粗（K2）、一级分枝数（K3）、叶长（K4）、叶宽（K5）、叶厚（K6）、单株鲜叶重（K7）、单株干叶重（K8）、叶茎比（K9）；考察干叶公顷产量（K10）；考察的品质性状包括RA含量（K11）、RA/总苷（%）（K12），RA公顷产量（K13），共13个指标，具体方法如下：

株高：测定时取中间行20株，每株用卷尺自地面量至生长点；主茎粗：用游标卡尺测定茎基部1 cm处的粗度；叶长：从生长点向下数第5对叶子，从叶尖量至叶基处；叶宽：量取叶子中间最宽处；叶厚采用游标卡尺测量，测定叶子中间厚度（不包括主叶脉）；将茎叶分离后，测定单株鲜叶重；自然阴干后，65℃烘箱烘至恒重，称量各材料的单株干叶重，单株干茎重，计算叶茎比，然后将干叶粉细后，装入样品袋待测糖苷。

采用Waters 2695高效液相色谱仪测定糖苷含量，优GB 8270-2014标准，流动相为乙腈和磷酸缓冲液，体积比为32∶68，色谱柱为兰州化物所的ATC18反相色谱柱，填料：Sino ODSAP，柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5μm，流速为1 mL/min，紫外检测波长为210 nm，根据出峰面积计算出RA含量及总苷含量。

1.4 数据处理

采用Execl 2003和SPSS19.0软件进行数据统计和分析，利用方差分析和多重比较对各指标进行显著性分析，并进一步运用灰色关联度[11]进行分析，具体如下。

1.4.1 确定参考序列X0及无量纲化处理

运用灰色系统理论，把所有供试的7份种质资源作为一个灰色系统。各品种为系统中的一个因素。把品种选育目标与优良品种的上限结合起来，构建一个理想品种，以理想品种的各性状指标构成参考数列，记为X0，试验品种的各性状值为比较数列，记为Xi（k）（i=1，2，3，…，m；k=1，2，3，…，n），其中m为参试品种数，本研究中m为7，n为性状数量，本研究中n为13。

采用初值化方法，即Xi数值分别除以X0，将原始数据无量纲化处理。

1.4.2 计算灰色关联系数

关联系数公式如下：

1.4.3 计算灰色关联度

等全关联度公式（2）、权重系数公式（3）、加权关联度公式（4）。

2 结果与分析

2.1 供试甜叶菊种质材料各指标分析

由表1可知，7个甜叶菊品种的农艺性状及产量表现不同。通过显著性分析可知，各组间株高差异不显著，且株高变化范围在65.00～80.33 cm；主茎最粗的为GY-27（X6），最细的为GY-24（X3），两者差异显著；一级分枝数最多的为GY-25（X4），为28.67个；叶长变化范围在5.20～7.33 cm之间；叶厚变化范围在0.43～0.87 mm之间；单株鲜叶产量和单株干叶产量最高的均为GY-23（X2），分别达240.70 g/株和66.54 g/株；叶茎比的平均值为1.00～1.44，干叶公顷产量最高的为GY-23（X2），可达7 984.8 kg/hm2，显著高于GY-27（X6）的4 488.0 kg/hm2。

甜叶菊干叶中糖苷分析结果如图1所示，GY-27（X6）的RA含量明显低于其余各品种，其余6个品种间RA含量不显著；RA/总苷比值最高的为GY-26（X5），最低的为GY-27（X6）；RA公顷产量最高的为GY-23（X2），最低的为GY-27（X6），两者之间差异显著。

表1 7个甜叶菊品种的农艺性状及产量Table1 Theagronomic character s and yield of 7 stevia varieties

图1 7个甜叶菊品种的RA含量Fig. 1 The RA content of 7 stevia varieties

2.2 灰色关联度分析

2.2.1 构建参考序列

本研究以选择出高产、高RA含量的甜叶菊品种为研究目标，参考数列X0的株高、主茎粗、一级分枝数、叶长、叶宽、叶厚、单株鲜叶产量、单株干叶产量、叶茎比、干叶产量、RA含量、RA/总苷及RA公顷产量，选用7份材料中最大测定值，构成最优指标集

2.2.2 无量纲化处理，并求绝对差值

各指标测定值的计量单位和量纲不同，不能直接进行比较，因此需要对各营养成分的初始数据进行无量纲化标准处理（表2），使数值压缩在[0，1]区间内，从而具有同等性和可比性[11]。

原始数据无量纲化后，求得7个材料Xi与参考数列X0的绝对差值（表3），其中二级最小差值为0，二级最大差值为0.8179。

表2 数据的无量纲化处理Table 2 Standard transformed data

2.2.3 求关联系数

7份甜叶菊种质材料与参考序列之间的关联系数根据公式（1）计算可得，结果如表4所示。

表3 X0与Xi的绝对差值Table3 Absolutedifferences between X0 and Xi

表4 7个甜叶菊品种与参考序列的关联系数Table4 Correlation coefficients of 7 stevia varieties and reference number series

2.2.4 计算关联度

由灰色关联度理论中的关联度分析原则[12]可知，参考序列的产量和品质最佳，甜叶菊各品种与参考序列的关联度越大，其综合性状就越好。根据等权关联度的公式（2）计算得出等权排序，等权关联度由大到小依次是GY-23（X2）＞GY-26（X5）＞GT-1（X1）＞GY-25（X4）＞GY-27（X6）＞GY-28（X7）＞GY-24（X3），等权关联度反映的是各测定性状对综合表现具有同等贡献[13]，而在甜叶菊品种综合表现中，每个性状指标对综合表现的贡献不同，因此采用加权关联度进行再次评价，利用权重系数公式（3）计算出各测定性状所占的比重，然后根据公式（4）算得加权关联度，结果如表5所示，加权关联度的排序和等权关联度完全一致，这使得分析结果更为准确，从而全面地反映了各品种在河西地区的表现优劣，为新品种选育提供指导。

表5 7个甜叶菊品种与参考序列的关联度Table5 Grey correlative degree among7 stevia varieties and reference number series

3 讨论与结论

利用灰色关联度分析对不同甜叶菊品种进行综合评价，克服样本数量小、数据不充分的困难，解决仅依靠产量或品质进行单一因素评价的问题[14]，保证研究结果更加全面、准确，在农业领域及综合评价方面得到了广泛应用[15]。

就评价因素而言，影响甜叶菊品种优劣的因素主要有产量和品质[16]，产量因素中叶片产量最为重要，甜叶菊叶片中含有多种不同的二萜糖苷类物质[2]，每种物质的含量、口感和甜度都各不一样，其中RA市场需求量大，因此，在品质因素中选用RA糖苷为评价因素，而同一植株不同叶位的含量存在差异，以植株中部含量最高[17]，因此取样部位一致，样品才具有代表性。

甜叶菊种质RA含量的测定包括提取、分离和检测3个步骤。每一个步骤都会影响最终结果。在提取叶片中的RA时，提取方法不同也会影响RA含量，如叶片的干燥方式，含水量以及提取液等[18-19]。液相色谱法是精确快速测定甜叶菊叶片中甜菊糖苷含量的理想方法[20-21]，甜菊糖苷的出峰时间会随着流动相中有机试剂比例和流速的改变而改变，但不同甜菊糖苷的出峰顺序只决定于色谱柱的类型[22]，同一样品在不同的条件下检测结果不同，而本研究所有样品均是在同一条件下检测，RA出峰时间约在7.6 min，因此可以进行糖苷比较。本研究对7个甜叶菊品种采用灰色关联度分析综合评价得出，GY-23、GY26和GT-1分别位列第一、第二和第三位，可以作为甘肃河西地区甜叶菊新品种选育的优良种质资源，在今后的研究中作为重点。而GY-24、GY-25、GY-27、GY-28可以作为研究其他性状的种质材料，如蛇菊苷（STV）或莱鲍迪苷C（RC）等，为市场所需的专用品种建立种质资源库。为此，本研究对甜叶菊新品种选育提供了一定的理论指导，为大面积甜叶菊种植提供了参考依据。