牛明福，陈金帅，李桃月，李俊毅，李阳

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003）

蚕蛹，作为我国桑蚕产业中大宗的副产物，资源十分丰富，它富含蛋白质[1]，包含18 种氨基酸，必需氨基酸的含量占40%[2]，氨基酸占比合理均衡，具有较高的营养价值[3]，是卫生部认可的优质的氨基酸来源[4]，但是对于干蚕蛹的利用，大多处于初加工阶段，真正的价值并未被开发利用，亟待进行深加工处理[5]。

蚕蛹蛋白酶解可以产生大量的多肽及寡肽[6]，这些多肽及寡肽具有较强的生理活性，其生理活性主要由酶解产物中的多肽氨基酸残基的组成决定[7]，这些生物活性肽有着较强的生理功能，具有提高机体免疫能力、促进脂肪代谢、降低高胆固醇、延缓衰老和清除自由基等功能[8-11]。闵建华等[12]探讨多种酶对蚕蛹蛋白的酶解，得出蛋白酶对蚕蛹蛋白有较好的酶解效果，且有较好的抗氧化作用。张明春等[13]以胰蛋白酶酶解蚕蛹蛋白，超滤制备生物活性肽，能够促进糖代谢中丙酮酸的生成。杨安树等[14]利用木瓜蛋白酶与风味蛋白酶，复合酶解蚕蛹蛋白，其多肽得率为32%。

目前蚕蛹蛋白酶解制备多肽或氨基酸的技术主要有：碱水解、酸水解，碱水解其腥味和褐变难以克服，且会造成消旋作用，影响其生理活性[15]；酸水解对水源造成污染，对设备造成腐蚀，且会使部分氨基酸破坏甚至完全破坏[16]；而采用酶解的方法，克服了酸碱水解的缺点，相对环保、经济、有效等[17-18]，因此文章选用酶解的方法，以DPPH·清除率、O2-·清除率、总还原能力和金属离子螯合力等常用体外抗氧化模型为指标，来研究酶解蚕蛹蛋白产物的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

蚕蛹：由伊川县桑农提供。中性、酸性、木瓜、猕猴桃、风味、复合、碱性、菠萝蛋白酶：合肥博美生物有限公司；DPPH：上海蓝季科技发展有限公司，1.10-菲啰啉：科密欧化学试剂有限公司，邻苯三酚：上海伊卡生物技术有限公司，无水乙醇：天津市风船化学试剂科技有限公司，石油醚：郑州海赛化工产品有限公司，盐酸：河南聚兴化工有限责任公司，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、三氯化铁：苏州市峰益化工有限公司，铁氰化钾：重庆昆仑化工有限公司，三氯乙酸、H2O2：奥德利化工产品销售有限公司，三羟甲基氨基甲烷（Tris base）：上海慧颖生物科技有限公司。

1.2 仪器和设备

N4 型紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；DJ-8D 型电热恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；101 型电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗有限公司；K9860 型全自动凯氏定氮仪：海能仪器有限公司；DSA50 超声波清洗机：福州德森精工有限公司；JB-2恒温磁力搅拌器：上海雷磁创益仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解产物的制备

1.3.1.1 脱脂蚕蛹粉的制备与酶解

取一定量蚕蛹，在电热鼓风干燥箱中60 ℃干燥24 h，至水分含量低于5%，粉碎过40 目筛，用索氏抽取法（溶剂石油醚）抽提三次脱去油脂，烘干直至恒重，置于干燥瓶内备用。

对蚕蛹蛋白酶解：分别取适量脱脂蚕蛹粉于试管中，加入一定pH 值的缓冲液，料液比为50 g/L，加酶量5 %，在最适温度下酶解3 h，后调节pH 值为7.0，6 000 r/min 离心后取上清液，酶解条件如表1 所示。

1.3.1.2 多肽得率的测定

凯氏定氮法测出样品中蛋白质含量m0，以及酶解液氮含量m1，茚三酮比色法测定游离氨基酸的质量m2，多肽得率如式 1 所示。

表1 8 种蛋白酶的酶解条件Table 1 Enzymatic conditions of 8 kinds of proteases

式中：D 为多肽得率；m1为酶解液中氮含量，g；m2为水解液中游离氨基酸含量，g；m0为样品中蛋白质含量，g。

1.3.2 抗氧化性研究

1.3.2.1 DPPH·清除能力的测定

DPPH·溶于有机溶剂能形成一种稳定的自由基，在517 nm 处[19]有强吸收，通过加入自由基清除剂，紫外吸收减弱，可以通过紫外分光光度计来测量其减弱程度，从而评价抗氧化剂的清除能力[20]。

测定方法依据代衍峰等[21]略作修改，取1.0mL样品液，加 2.0mLDPPH 溶液（0.1 mmol/L），振荡均匀，室温避光反应30 min，6 000 r/min 离心取上清，于517 nm处测吸光度A1，取1.0mL样品液，加入2.0mL无水乙醇测其吸光度A2，以1.0mL去离子水代替样品作空白对照测量其吸光度A0，按公式（2）计算。

式中：C1为 DPPH·清除率；A1为样液加 DPPH 所测的吸光度；A2为样液加无水乙醇的吸光度；A0为去离子水加DPPH 的吸光度。

1.3.2.2 O2-·清除能力的测定

邻苯三酚在碱性条件下自氧化生成有色中间产物及O2-·，在紫外325 nm 处其吸光度随之而增加，加入抗氧化剂，O2-·被清除，使有色产物的生成被阻碍，导致吸光度的下降，通过紫外分光光度计测吸光度的大小，来评价样品对O2-·的清除能力。

测定方法依据王戈莎等[22]，取0.1 mol/L，pH 8.2 Tris-HCl 缓冲液 2.80 mL（其中含有 2 mmol/L EDTA），加0.10mL样液混匀，于25 ℃水浴中保温10 min，后加入25 ℃水浴预温的3 mmol/L 的邻苯三酚0.10 mL，混匀后迅速于干燥的石英比色皿中，在325 nm 下每隔0.5 min 测定一次OD 值，反应4.5 min 结束。以0.1mol/L，pH 8.2 Tris-HCl 缓冲液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品，作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按下式计算样品对O2-·的清除率。

式中：C2为 O2-·清除率；V1为对照组邻苯三酚自氧化速率△OD/min；V2为样品组邻苯三酚自氧化速率△OD/min。

1.3.2.3 总还原能力的测定

铁氰化钾中的Fe3+被抗氧化剂还原成Fe2+，生成的产物在700 nm 处有最大吸收[23]，通过紫外分光光度计测其在700 nm 处的吸光度，可以评价样品还原能力的大小，样品的还原力与抗氧化能力正相关。

将2.0mL样品溶液与5.0mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 值为 6.6）混匀，加入 5.0mL质量分数为1%铁氰化钾溶液，将混合物在50 ℃下保温20 min，最后加入5.0mL体积分数为10 %的三氯乙酸（Trichloroacetic acid）溶液，混匀在 3 000 r/min 下离心10 min。取2.0mL上清液和1.0mL蒸馏水混合，加入0.5mL质量分数为0.1%氯化铁溶液，于700 nm 下测量吸光度，吸光度越高说明样品的还原能力越强。

1.3.2.4 金属离子螯合力的测定

过渡金属铁、铜等可以引起脂肪过氧化反应，导致生物膜受到损害，产生了有毒的过氧化物[24]，通过样品对金属离子螯合的能力来体现其抗氧化机制。

取 800 μL 样品液（20 mg/mL）置于试管中，加入10 μL 氯化亚铁溶液（2 mmol/L）和 20 μL 菲啰啉溶液（5 mmol/L），混匀后于室温反应 10 min，于 562 nm 下测其吸光度。

2 结果与分析

2.1 酶解产物的制备

2.1.1 蚕蛹粉的脱脂

脱脂后滤渣烘干，除去残存溶剂，研磨后过筛，获得精制脱脂蚕蛹粉，蛋白质含量64.32%。对脂质提取液减压蒸馏，低温脱溶分离得到油脂和溶剂，得出蚕蛹的油脂含量为29.63%。

2.1.2 多肽得率的分析

酶解蚕蛹蛋白的多肽得率结果如图1 所示。

图1 酶解蚕蛹蛋白的多肽得率Fig.1 Peptide yield of enzymatic hydrolyzed silkworm protein

8 种酶解蚕蛹蛋白多肽得率有较大差异，碱性蛋白酶酶解的多肽得率最高13.99%。酸性蛋白酶酶解的最低为7.37%。可能的原因是不同蛋白酶酶解效率具有较大差异，酶切位点也不太一致，因此酶解得到的蚕蛹蛋白多肽的分子质量大小不同，导致多肽得率有所不同。碱性蛋白酶的酶解效率最高，但其产物的抗氧化性能还需要进一步试验。

2.2 抗氧化性能研究

2.2.1 DPPH·清除性能研究

若蛋白酶解产物能清除DPPH 所形成的自由基，则能表现出清除能力，试验通过DPPH·清除率的高低来研究酶解产物的抗氧化性能。不同酶解产物DPPH·清除能力的测定结果如图2 所示。

图2 蚕蛹蛋白酶解多肽对DPPH·清除率Fig.2 DPPH·scavenging rate of silkworm proteolytic polypeptide

由图2 可知，猕猴桃蛋白酶酶解产物的清除率最高为42.34%，碱性蛋白酶清除率次之为38.91%，酸性蛋白酶清除率最低为22.32%。结合多肽得率的测定结果，可能的原因是蛋白酶具有专一性，因此不同蛋白酶对同一种蛋白作用的结果不同，导致不同蛋白酶酶解的蚕蛹蛋白多肽分子量及自身结构具有差异，清除DPPH·的能力也有所区别，因此表现的清除能力不同。碱性蛋白酶的多肽得率为13.99%比猕猴桃蛋白酶的高，但后者DPPH·清除率却比碱性蛋白酶的高，表明了多肽含量的高低并不能决定清除能力的强弱。

2.2.2 O2-·清除性能研究

O2-·是氧基态接受电子形成的一个氧自由基，经过一系列反应容易形成其他有害的氧自由基，与多种疾病有着密切联系，因此清除其对于蛋白酶解产物抗氧化性的表现有着重要作用。酶解产物的O2-·清除能力的测定结果如图3 所示。

图3 蚕蛹蛋白酶解多肽对O2-·清除率Fig.3 Clearance rate of silkworm chrysalis proteolytic polypeptide to O2-·

由图3 可知，碱性蛋白酶酶解产物的清除率最高为43.69%，木瓜蛋白酶酶解产物最低为14.65%。结合多肽得率的测定结果，可能的原因是木瓜蛋白酶多肽得率偏低，酶解产生的生理活性肽较少，影响了O2-·自由基的清除能力。

2.2.3 总还原能力研究

还原力是体现酶解产物提供电子能力的重要指标，自由基通过结合酶解产物提供的电子变成稳定的分子，从而失去活性，酶解产物表现出抗氧化作用。酶解产物还原能力的测定结果如图4 所示。

图4 蚕蛹蛋白酶解多肽的总还原能力Fig.4 The total reduction ability of silkworm proteolysis polypeptides

由图4 可知，8 种蛋白酶酶解产物都具有一定的还原能力，碱性蛋白酶酶解产物其还原能力最高为1.982，酸性蛋白酶的最低为0.852，可能的原因是碱性蛋白酶等的酶解产物提供电子的能力优于酸性蛋白酶酶解的，从而使自由基变为稳定物质失去活性，阻断了自由基的链式反应，发挥了较强的抗氧化作用。另一个可能的原因是，酸性蛋白酶反应缓冲液的pH值低，对酶解产物的活性有所改变，影响了其还原能力。

2.2.4 金属离子螯合力研究

亚铁离子会加速脂质的氧化过程，因此可以通过测定酶解产物对金属离子的螯合力来评价其抗氧化性。金属离子螯合力的测定结果见图5。

图5 蚕蛹蛋白酶解多肽金属离子螯合能力Fig.5 Chelating ability of silkworm protease polypeptide to metal ions

由图5 可以得出，8 种蛋白酶酶解产物都具有一定的金属螯合能力，蛋白酶酶解产物其螯合力最高为0.624，风味蛋白酶的最低为0.221，可能的原因是碱性蛋白酶酶解产物中含有较多的氨基羧酸类或是羟基羧酸类物质，而这类物质有较强的金属螯合力，因此螯合金属离子的能力较强，风味蛋白酶酶解产物中的含有的这类物质较少，其螯合力较弱。

2.2.5 综合抗氧化性能分析

试验利用8 种蛋白酶分别对蚕蛹蛋白进行酶解，测定了酶解产物对DPPH·、O2-·的清除能力，比较了总还原能力和金属离子螯合力的大小，较全面的评价了缫丝后脱脂蚕蛹蛋白多肽的抗氧化活性，结果表明：在加酶量一定的前提下，猕猴桃蛋白酶酶解产物对DPPH·清除率最高为42.34%，碱性蛋白酶酶解产物对O2-·清除率最好43.69%，总还原能力碱性蛋白酶酶解产物最高为1.982，金属离子螯合力碱性蛋白酶酶解产物最佳为0.624。试验结果还揭示了酶解产物多肽得率的高低与其抗氧化能力并没有正相关性，这可能与各种酶的酶切位点不同相关，导致生成多肽的大小和含量有差异，酶解多肽氨基酸的结构和组成也不尽相同，致使其抗氧化活性能力差异较大，为下一步多肽的具体分析奠定了基础。

3 结论与讨论

以缫丝后的蚕蛹蛋白粉为原料，分别选用中性蛋白酶等进行水解，以DPPH·清除率、O2-·清除率、总还原能力、金属离子螯合力等作为检测抗氧化活性的指标，较全面的评价了酶解产物的抗氧化活性。发现了碱性蛋白酶酶解得到的产物表现出了较好的综合抗氧化的能力，DPPH·清除率为38.91%，O2-·清除率为43.69%；总还原能力为1.982，金属离子螯合力为0.624。

据文献报道蚕蛹酶解产物多肽有着明显的自由基清除能力及抗氧化性。包立军等[25]以DPPH·清除率为指标，研究了天然家蚕及蚕丝酶解的多肽活性，实验得出DPPH·清除率平均为62.26%；左振宇等[26]选用碱性和中性蛋白酶作为最适水解酶，在最适条件下酶解得出多肽得率33.29%，O2-·清除率为40.57%，但是其采用超声处理的方法可能会对产物多肽的活性造成一定的影响，贾俊强等[27]采用碱性蛋白酶酶解蚕蛹蛋白，制备了血管紧张素转换酶抑制肽（Angiotensin converting），并得出了酶解产物对ACE 的抑制率达96.67%；刘曼丽[28]采用体外消化模型对蚕蛹蛋白进行了处理，制备了消化多肽，并对其抗氧化活性和抗肿瘤活性进行了研究；王伟等[29]研究表明混合蛋白酶水解得到的蚕蛹多肽具有良好的抗氧化活性。本文选用8 种蛋白酶，对缫丝后脱脂蚕蛹粉进行酶解，采用4 种抗氧化能力检测体系较全面分析了酶解产物的综合抗氧化性，为进一步深入研究蚕蛹酶解多肽的生理活性奠定了基础。作为抗氧化产品，酶解蚕蛹活性肽可以作为补充膳食的功能食品和化妆品添加剂，将体现出越来越高的价值。大力发展蚕蛹活性肽的研发和生产可以推动当地蚕丝产业的转型和振兴，促进当地经济快速发展。