高林晓，郭蒙，郭茂鸿，赵前程，吴伟，杨再波

（1．黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀558000；2．贵州省普通高校民族药用植物资源开发工程研究中心，贵州都匀558000）

刺三加[Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.]，属于五加科五加属攀援状灌木，又名苦刺芽、刺三甲、白簕、三甲皮、鸡脚菜、苦粉竻和苦刺芯等。其性平，辛微苦凉，气微香，广泛分布于我国中南部地区。刺三加根和皮作为药物使用已经有悠久的历史，特别在东南亚一带，把刺三加根作为与人参同样功效的药物使用，具有祛风逐湿、散瘀止痛、舒筋活血、消肿解毒和止咳平喘等功效[1-3]。相关文献对刺三加叶中化学成分、药理作用和毒理活性等方面作了比较系统的归纳总结，其主要的有效化学成分包括皂苷类、黄酮类、挥发性成分、多糖类等[4-8]，但有关刺三加根中多酚的提取工艺优化和含量测定的研究鲜有报道。

研究表明植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、降血脂、预防癌症和清除自由基等功能[9-10]，其提取分离工艺研究越来越引起人们的重视。植物多酚传统的提取方法有煎煮法、渗漉法、有机溶剂法以及回流提取法等，这些传统的方法提取效率低、有效成分损失太多，存在杂质较多、影响药效等缺点；现代提取方法有超声辅助提取法、酶辅助提取法、微波辅助提取法以及超临界流体萃取法等，与传统提取方法相比，这些现代提取方法具有提取物纯度高，操作简单，收率高，节能等优点[11]。综合考虑，本试验选择超声辅助提取的方法。目前，针对总多酚各物质的结构特点而发展的含量测定方法主要有福林酚法[12-14]、高效液相色谱法[15-16]、高锰酸钾滴定法[17]、酒石酸亚铁分光光度法[18]和铁氰化钾分光光度法[19-20]等，由于比色法简单、成本低、分析速度快，因此，本试验选用酒石酸亚铁法测定刺三加根中总多酚含量，并以总多酚的提取率为考察指标，采用正交试验设计，优选出最佳提取工艺条件，为刺三加总多酚的合理利用和药用部位的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺三加根采自广东恩平，经黔南民族师范学院生物科学与农学院黄小娜副教授鉴定为五加科五加属植物刺三加根。采后于45 ℃烘干，粉碎过60 目筛，封口包装。置闭光、阴凉处存放，待用。

没食子酸对照品（纯度≥98%，批号：BM170623）：合肥博美生物科技有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）：天津市致远化学试有限公司；无水磷酸二氢钠（分析纯）：天津市化学试剂批发公司；硫酸亚铁（分析纯）：重庆茂业化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FW177 高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；DL-360D 智能超声波清洗器：上海之信仪器有限公司；80-1 电动离心机：金坛市城东新瑞仪器厂；BS110S 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺三加根前处理及总多酚提取

准确称取15.00 g 干燥、粉碎、过60 目筛后的刺三加根粉末，置于250mL锥形瓶中，室温下，加150 mL石油醚对其进行浸泡，使刺三加根粉末中的油脂溶解到石油醚中，也可以去除大多数溶剂型的有机物色素，重复2 次，至石油醚层几乎无色，第二次进行抽滤，倾去醚液，滤渣样品置于通风处自然干燥备用。准确称取一定量的上述干燥的滤渣样品，加入一定料液比的乙醇水溶液，置于超声波中，在一定温度下提取一定时间后，将提取液冷却、离心、分离，取上清液即得样品总多酚提取液。

1.3.2 没食子酸标准曲线绘制

称取 0.5 g 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和 2.5 g 酒石酸钾钠（KNaC4H4O8·4H2O），加蒸馏水溶解并转移至500mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀[21]，得酒石酸亚铁溶液。

准确称取60.012 3 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和10.265 9 g 无水磷酸二氢钠，用蒸馏水溶解，并转移定容至1 000mL容量瓶中，摇匀，得pH 值为7.5 磷酸盐缓冲液，常温保存，备用。

准确称取食子酸对照品0.125 2 g，置于250mL棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容至刻度，摇匀，即得没食子酸标准溶液为0.500 8 mg/mL。

分别精密移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的0.500 8 mg/mL 没食子酸标准溶液，置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至体积到5.0 mL，再加入酒石酸亚铁溶液5.0 mL，用pH 值为7.5 的磷酸盐缓冲溶液定容至25 mL，混匀，室温下静置15 min，以试剂空白为参比，在540 nm 处测定其吸光度[22]。以没食子酸标准溶液的浓度（C，mg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线得线性回归方程：A=13.045 6 C+0.023 5（r=0.999 5）。研究结果表明，没食子酸浓度在0.004 mg/mL～0.060 mg/mL 范围内与吸光度呈现出良好的线性关系。

1.3.3 刺三加根中总多酚含量测定方法

准确移取2.0mL样品提取液于容量瓶中，依次加蒸馏水至体积到5.0 mL，酒石酸亚铁溶液5.0 mL，用pH 值为7.5 的磷酸盐缓冲溶液定容至25 mL，混匀，室温下静置15 min，以试剂空白为参比，在540 nm 处测定吸光度值。并根据没食子酸线性回归方程计算样品提取液中总多酚含量，同时平行试验3 次。按下式计算总多酚提取率：总多酚提取率/%=样品提取液中总多酚含量/样品质量×100。

1.3.4 单因素试验

按照1.3.1 和1.3.3 中的试验方法对刺三加根中的总多酚进行提取和含量测定，固定超声波的功率为100 W，乙醇体积分数分别取30%、45%、60%、75%、90%；料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；超声时间为 15、30、45、60、75 min；超声温度为 20、30、40、50、60 ℃，分别考察乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度4 个因素对刺三加根中总多酚提取率的影响[23]。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的确定

精密吸取按最优条件提取的刺三加根样品溶液2.0 mL、没食子酸对照溶液1.5 mL，分别置于25mL容量瓶中，依次各加入蒸馏水至体积到5.0 mL，酒石酸亚铁溶液5.0 mL，用pH 值为7.5 的磷酸盐缓冲溶液定容至25 mL，混匀，室温下静置15 min，以试剂空白为参比，在波长为400 nm～850 nm 范围内扫描吸收光谱见图1。

图1 吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum

由图1 可知，刺三加根中总多酚的最大吸收波长是540 nm，与对照溶液没食子酸反应后产物的最大吸收波长一致。由此本试验的最佳吸收波长选择为540 nm。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对刺三加根中总多酚提取的影响

在料液比 1∶30（g/mL）、提取时间 30 min、提取温度30 ℃条件下，采用乙醇体积分数分别为30%、45%、60%、75%、90%的溶剂进行超声辅助提取，总多酚提取率结果见图2。

图2 乙醇体积分数对总多酚提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total polyphenols

由图2 可知，随着乙醇体积分数的增加，总多酚的提取率呈下降趋势，可能是因为乙醇体积分数大时，乙醇引起蛋白质变性在细胞壁形成致密结构间接阻碍了多酚物质的溶出，也有可能是因为提取溶剂乙醇与多酚之间的极性差异增大，导致总多酚的提取率呈下降趋势。因此，选择乙醇体积分数为45%。

2.2.2 料液比对刺三加根中总多酚提取的影响

在乙醇体积分数45%、提取温度30 ℃、提取时间30 min，料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的条件下，考察不同料液比对刺三加根中总多酚提取效果的影响，总多酚提取率结果见图3。

图3 料液比对总多酚提取率的影响Fig.3 Effect of material-liquid rate on the extraction rate of total polyphenols

由图3 可知，当料液比为 1∶30（g/mL）时，总多酚的提取率达到最大，随后又减小，可能是因为当乙醇体积达到足够大时，多酚可以全部溶出；当刺三加根粉末的量过大时，只有部分多酚溶出，导致多酚的提取率下降。因此，选择料液比为1∶30（g/mL）。

2.2.3 提取时间对刺三加根中总多酚提取的影响

在乙醇体积分数 45%、料液比 1∶30（g/mL）、提取温度30 ℃条件下，考察超声辅助提取时间对刺三加根中总多酚提取效果的影响，总多酚提取率结果见图4。

图4 提取时间对总多酚提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total polyphenols

由图4 可知，在 15 min～45 min 内，刺三加根中总多酚提取率呈迅速增加的趋势，当提取时间达到45 min时，总多酚的提取率达到最大值。但超过45 min 后，多酚提取率则呈下降趋势，其原因可能是随着超声辅助提取时间的延长，会使得一些醇溶性杂质成分的溶出量增加，这些成分与多酚类化合物竞争同乙醇分子的结合，从而导致多酚提取率下降[23]。因此，选择超声辅助提取时间为45 min。

2.2.4 提取温度对刺三加根中总多酚提取的影响

准确称取0.5 g 样品5 份，加入45%的乙醇溶液15mL，分别在 20、30、40、50、60 ℃超声辅助提取 45 min，提取液冷却后离心分离，取上清液进行测定，计算总多酚的提取率，总多酚提取率结果见图5。

图5 提取温度对总多酚提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total polyphenols

由图5 可知，超声温度从20 ℃增加到50 ℃时，总多酚提取率呈增加趋势，后随着温度增加，总多酚提取率有所下降，可能是温度过高，总多酚的分子结构受到破坏，从而导致总多酚提取率下降，故选择超声辅助提取的温度为50 ℃。

2.3 正交试验

依据单因素试验结果确定4 个因素的合理水平，采用L9（34）进行正交试验设计，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

以刺三加根中总多酚的提取率为考察指标，正交试验设计优化总多酚最佳超声辅助提取工艺，正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

由表2 分析可知，极差最大的为D 因素，影响刺三加根中总多酚提取率的主次因素为：D＞B＞C＞A，即在一定范围内，超声辅助提取温度对总多酚提取率影响最大，然后依次是料液比、超声时间、乙醇体积分数。各因素的最佳组合为D3B2C2A1，即提取条件为提取温度 60 ℃、料液比 1∶30（g/mL）、提取时间 45 min、乙醇体积分数为35 %。此条件下多酚的提取率最高为1.37%，高于正交试验中每次试验的测定结果。

为了进一步确定各因素对刺三加根中总多酚提取效果的影响，对表2 结果进行方差分析和显著性检验，由于A 因素的R 值最小，将其作为空白列进行计算，结果见表3。由表3 可以看出，料液比和超声温度对结果的影响是显著的，乙醇体积分数和提取时间对结果并无显著影响。

表3 正交试验结果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the result of orthogonal experiment

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度试验

精密移取1.5mL没食子酸对照溶液6 份，按照1.3.3 试验方法测定，记录其吸光度，计算得相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为 0.83%（n=6），这表明仪器精密度是良好的。

2.4.2 重复性试验

取同一批次的刺三加根6 份，按最佳提取条件制备样品提取液，按照1.3.3 试验方法测定其吸光度，计算吸光度的RSD 为1.38%，表明该方法重复性好。

2.4.3 稳定性试验

取同一批次的样品提取液，分别在 0.25、1、2、4、6、8、12 h 按1.3.3 的试验方法测定其吸光度，结果表明，溶液显色后0.25 h～12 h 时间内样品溶液的吸光度变化不大，计算其RSD 为0.69%，说明这12 h 内反应产物的稳定性良好。

2.4.4 加标回收率试验

按最佳提取条件平行制备样品提取液6 份，各准确吸取1.5mL样品溶液，置25mL棕色容量瓶中，按1.3.3 项下试验方法，测定其吸光度，并计算总多酚含量。从上述6 份样品溶液中各移取1.5 mL，没食子酸标准溶液1.0 mL，置25mL棕色容量瓶中，按1.3.3 项下试验方法，测定其吸光度，并计算总多酚含量，结果见表4。

表4 加标回收率试验结果Table 4 Experiment results of average recovery

由表4 可知，总多酚平均回收率为99.59%，RSD为1.27%。

2.5 样品含量测定

结合单因素试验和正交试验优化结果分析，选择乙醇体积分数 35 %、料液比 1∶30（g/mL）、提取时间45 min、提取温度60 ℃的条件下，制备样品提取液，同时测定其吸光度，代入线性回归方程计算总多酚含量，并计算总多酚提取率，结果见表5。

由表5 可知，其总多酚平均值为13.45 mg/g，RSD（n=6）为1.38%，总多酚提取率平均值为1.34%。

3 结论与讨论

本试验选择乙醇为提取溶剂，采用超声波辅助提取刺三加根中总多酚。通过单因素试验和L9（34）正交试验，优化超声辅助提取刺三加根中总多酚的最佳工艺条件为：乙醇体积分数为35%、料液比1∶30（g/mL）、提取时间45 min、提取温度60 ℃，在此条件下，总多酚的提取率最高，平均值为1.34%。

总多酚的含量测定方法有高锰酸钾、福林酚、铁氰化钾分光光度、高效液相色谱和酒石酸亚铁等方法，由于高锰酸钾滴定法滴定终点较难观察；福林酚法灵敏度较高，简便易行，但对环境温度要求高；铁氰化钾分光光度法对时间敏感，且显色稳定时间短，对测定条件要求严格；高效液相色谱法灵敏度高、专属性强，分析成本高，仪器价格及日常维护费用贵。因此，本试验选用酒石酸亚铁分光光度法测定刺三加根中总多酚的含量。结果表明，该方法操作简单易行，重复性、稳定性好，精密度高，可用于刺三加根中总多酚的含量测定。