苗梦媛 刘守胜 赵真真 徐颖誉 辛永宁 宣世英

1南京医科大学附属青岛临床医学院（山东青岛266011）；2青岛市市立医院中心实验室（山东青岛266071）；3青岛大学（山东青岛266071）；4青岛市市立医院感染科（山东青岛266011）

冠心病是影响全球的主要心血管疾病之一，已被证明是发达及发展中国家死亡的主要病因［1］。遗传因素在冠心病的发生、发展中起到了重要作用［2］。OZAKI 等［3］首次通过全基因组关联研究（GWAS）发现细胞毒素-α基因位点与心肌梗死有关。目前为止，GWAS 已经发现了163 个冠心病遗传易感基因［4］。进一步研究冠心病遗传易感因素，对冠心病的早期诊断和预后具有重要意义。

PNPLA3 属 于patatin 样 磷 脂 酶 域（PNPLA）家族，是由481 个氨基酸组成的脂肪滋养蛋白。PNPLA3 rs738409 位点变异可降低酶的活性，阻止甘油三脂水解，导致甘油三脂的蓄积，从而影响血脂水平［5］。血脂异常与冠心病密切相关，故推测PNPLA3 rs738409 基因多态性很有可能为冠心病潜在的发病机制之一。然而国外关于PNPLA3基因多态性与冠心病的相关性研究较少，国内尚无相关报道。本文将针对PNPLA3 rs738409 位点多态性与青岛地区汉族人群冠心病的关系进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本试验遵循《赫尔辛基宣言》及其附录的准则，获得本院伦理委员会批准［6］。所有受试者均签署书面知情同意书。选取2018年7月至12月青岛市市立医院收入院的199 例冠心病患者为研究对象。通过经皮冠状动脉造影确诊为冠心病，并且由两位经验丰富的介入心脏病学家进行评估。诊断标准依据中华医学会心血管病分会制定的诊断标准，冠状动脉至少一支主要分支管腔直径狭窄在50%以上［7］。排除标准：（1）合并其他心脏疾病；（2）既往接受静脉溶栓、冠状动脉支架置入术或冠状动脉旁路移植术的患者。对照组为同期本院体检中心健康体检的无冠心病的人群，共纳入160 例。所有受试者均被排除在糖尿病、严重感染、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤及药物滥用史，相互之间无亲缘关系。采用问卷调查法收集受试者的基础临床信息。

1.2 标本采集 所有受试者均于空腹12 h 后于次日清晨抽取4 mL 正中静脉血，分两管置于EDTA抗凝管中，其中一管抗凝血送检验科，用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、血糖（Glu）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）检测；另一管抗凝管置于-80 ℃冰箱中保存，以备DNA 的提取，用于基因型的检测。同时对受试者性别、年龄、身高等基本信息进行统计，计算体质量指数（BMI）= 体质量（kg）/身高（m）2［8］。本研究未记录包括运动和饮食情况在内的环境因素。

1.3 DNA 提取及基因型检测 采用血液基因组DNA 提取试剂盒（百泰克生物技术有限公司，北京）进行全血基因组DNA 提取，提取的基因组DNA存放于-20 ℃冰箱备用。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法进行PNPLA3目的基因的扩增，检测基因型。PCR 引物由北京博淼生物科技设计合成，具体引物序列为：上游引物：5′-ACGTTGGATGCCCCTCTTATCTCTGTTTCG-3′下游引物：5′-ACGTTGGATGCAGTGTCACTTCATTTAGCC-3′。引物浓度均为10 μmol/L，-20 ℃冰箱保存。PCR 扩增程序为：首先94 ℃预变性30 s，然后进行40 个循环的扩增反应，每个扩增反应的程序为94 ℃变性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s。循环结束后保持72 ℃运行3 s，后降至4 ℃保存。对所得到的PCR 产物进行去磷酸化处理，然后进行目的序列的单碱基延伸反应，对所得产物进行质谱分型鉴定，检测结果使用TYPER 4.0 软件获取原始数据。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件对所得数据进行统计分析。采用χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡法则，以确认样本的群体代表性。采用χ2检验分析两组间性别、基因型及等位基因频率的差异性。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；不符合正态分布的用中位数（最小值～最大值）表示，两组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。基因多态性与冠心病发生的相对风险度以比值比（OR）及其95%置信区间（95%CI）表示，应用非条件Logistic 回归模型计算OR及95%CI。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 冠心病组共纳入199 例患者，其中男112 例，女87 例；健康对照组共纳入160 例，其中男74 例，女86 例。两组研究对象性别比例的差异无统计学意义（P＞0.05）。冠心病组患者的年龄、体质量、BMI、Glu、ALT、γ-GGT、ALP 和TBIL水平显著高于健康对照组，HDL 水平显著低于健康对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

2.2 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的频率分布 在冠心病组和对照组均检出CC、CG、GG3种基因型，两组rs738409 基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（冠心病组χ2=0.210，P=0.647，对照组χ2=0.001，P=0.971），具有群体代表性。两组间基因型及等位基因的分布频率的差异均无统计学意义（均P＞0.05，表2）。非条件Logistic 回归模型分析显示：CG 、GG 基因型携带者分别与CC 基因型携带者相比较，二者差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CG + CG 携带者与CC 携带者相比，发病风险未增加（OR=1.037，95%CI：0.683～1.575，P=0.865）；调整年龄、性别、BMI 后，差异仍无统计学意义（校正OR=1.127，95%CI：0.640～1.986，P=0.678）。G 等位基因的携带者对比C 等位基因携带者，所得结果差异无统计学意义（P＞0.05），在调整年龄、性别及BMI 的影响后，结果仍无改变（P＞0.05，表3）。

2.3 不同组内突变等位基因非携带者与携带者之间临床特征的比较 在冠心病组、健康对照组的各自组内比较中，PNPLA3 rs738409 G 等位基因的携带者与非携带者之间年龄、性别、BMI、Glu、TG、TC、HDL、LDL、ALT、AST、γ-GGT、ALP 及TBIL 指标比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表4。

表1 冠心病组和对照组一般临床资料比较Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s

表1 冠心病组和对照组一般临床资料比较Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s

注：BMI，体质量指数；Glu，血糖；TG，甘油三酯；TC，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天门冬氨酸氨基转移酶；γ-GGT，谷氨酰转肽酶；ALP，碱性磷酸酶；TBIL，总胆红素

t/χ2/Z 值15.220 3.575 1.464 2.716 2.568-6.632-1.955 1.475-7.765 1.687-3.654-1.823-4.357-4.078-2.070 P 值＜0.001 0.059 0.144 0.007 0.011＜0.001 0.051 0.141＜0.001 0.093＜0.001 0.068＜0.001＜0.001 0.038指标年龄（岁）男/女（例）身高（cm）体质量（kg）BMI（kg/m2）Glu（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）γ-GGT（U/L）ALP（U/L）TBIL（μmol/L）冠心病组（n=199）67.35±11.56 112/87 168.49±6.34 69.84±10.58 24.61±3.29 5.24（2.28～18.33）1.36（0.05～6.09）4.57±1.32 1.00（0.35～1.83）2.78±1.08 21.95（5.70～156.66）21.82（10.13～223.90）27.50（9.47～171.78）81.42（28.72～194.44）13.40（2.50～63.90）对照组（n=160）48.21±12.19 74/86 167.34±8.13 66.61±11.86 23.70±3.39 4.56（2.92～17.08）1.18（0.41～6.67）4.37±1.12 1.28（0.50～3.60）2.62±0.59 18.23（6.49～236.13）20.46（10.94～150.43）19.61（7.52～374.46）69.65（30.70～182.29）12.05（3.90～29.20）

表2 冠心病组和对照组PNPLA3 rs738409 基因型和等位基因的分布Tab.2 Distributions of the PNPLA3 rs738409 genotype and allele in CAD and control groups 例（%）

3 讨论

冠心病是心血管病中首要危险因素，其发病率及病死率逐年上升。PNPLA3 是调节TG 代谢的重要因子，大量证据表明TG 与罹患冠心病风险呈正相关，降低TG 水平可降低冠心病发生风险［9］。本研究采用病例对照的研究方法，对PNPLA3基因多态性与冠心病的相关性进行探讨。本研究结果显示PNPLA3 rs738409 位点多态性与冠心病发病风险无显著相关性，调整混杂因素后，差异仍无统计学意义。该结果与此前墨西哥一项针对PNPLA3 基因多态性与冠心病相关性的研究结果相一致［10］。PETTA 等［11］发现在携带PNPLA3 rs738409 GG 基因型的NAFLD 患者发生颈动脉粥样硬化的风险增高。另有一项欧洲大数据人群研究表明PNPLA3 rs738409 G 等位基因对冠心病有一定的保护作用［12］。该结论在德国人群中进一步得到证实，rs738409 G 等位基因与TC、LDL 水平呈负相关，与罹患冠心病的风险亦呈负相关［13］。

表3 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的发病风险Tab.3 Correlation of PNPLA3 rs738409 genotype and allele with the risk of CAD

既往有研究表明PNPLA3 与ALT 水平显著相关，ALT 水平升高，心血管疾病患者病死率更高［14］。然而本研究PNPLA3 rs738409 G 等位基因非携带者与携带者在冠心病组、健康对照组的各自组内比较中，血脂、肝功能各项指标差异均无统计学意义。分析其原因可能为，本次研究对象仅限于青岛地区人群，考虑到不同种族地区人群的遗传背景差异较大，后续研究应在更多地区、更多人群中开展。

综上所述，目前国外关于PNPLA3 rs738409 多态性与冠心病相关性的研究整体偏少，且所得结论不一。本研究为国内关于PNPLA3 与冠心病相关性的首次探讨，但仍存在一定的不足。地域条件、样本数量等条件限制，以及部分确诊冠心病患者通过降脂药物进行临床干预，均可能在一定程度上影响了结果的准确性。尽管本研究所得结论是阴性的，但仍可为后续的研究提供参考。

表4 PNPLA3 rs738409 G 等位基因非携带者与携带者的临床特征比较Tab.4 Analysis of clinical characteristics in PNPLA3 rs738409 G allele carriers and non-carriers of the study population x±s