崔红霞，郭雪莹，王 明，王伟明#

(1.黑龙江省中医药科学院中药研究所，黑龙江 哈尔滨 150036； 2.齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

中药青龙衣(greenwalnuthusks)是胡桃科胡桃树属植物胡桃(Juglandsmandshuricamaxim)和胡桃楸(JuglandsragiaL)未成熟果实的干燥果皮[1]，现代研究结果表明，青龙衣对胃癌、白血病等具有良好的抗肿瘤活性[2-3]。复方青龙衣膏的主要成分为中药青龙衣乙醇提取物，是黑龙江省中医药科学院独立开发、具有自主知识产权的针对消化系统肿瘤的膏剂，2004年获得医院制剂批文[黑药制字(2004)Z第0061]。前期研究结果表明，复方青龙衣膏可抑制胃癌生长，故本研究探讨了青龙衣膏对BGC-823细胞侵袭能力的影响，为青龙衣的深入开发及临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 细胞

人胃腺癌BGC-823细胞株购自黑龙江省肿瘤研究所。

1.2 药品与试剂

青龙衣膏由黑龙江省中医药科学院中药研究所制备；RPMI-1640细胞培养基(美国HYCLONE公司)；Transwell小室(美国康宁公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)。

1.3 仪器

Safire2高速多通道波长酶标仪(奥地利TECAN公司)；Alpha Imager Is 2200型凝胶成像系统(美国Alphaimager公司)。

2 方法

2.1 MTT法检测青龙衣膏对胃癌细胞BGC-823生长增殖的影响

将对数生长期的肿瘤细胞，接种于96孔培养板中，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，将其分为实验组和对照组。实验组细胞加入含不同浓度青龙衣膏(0.818、0.909、1.010、1.123、1.247、1.386、1.540及1.710 mg/ml)的培养液200 μl，对照组细胞加入培养液200 μl。每组设3个平行孔，继续培养24 h或48 h。每孔加入新鲜配制的含5 mg/ml的MTT 10 μl，继续培养4 h。小心弃上清液，并加入DMSO 150 μl，混匀，在酶标仪上以试验波长570 nm测定光密度(OD)。计算细胞生长抑制率(GIR)及半数抑制浓度(IC50)。GIR=(1-实验组OD/对照组OD)×100%。IC50的计算公式为：lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]。其中，Xm为lg最大剂量；I为lg(最大剂量/相临剂量)；P为阳性反应率之和；Pm为最大阳性反应率；Pn为最小阳性反应率。

2.2 MTT法测定青龙衣膏对胃癌细胞株BGC-823黏附能力的影响

将4 ℃过夜融化的Matrigel基质胶在无菌条件下包被到96孔板上，每孔50 μl，培养箱内放置30 min，2%胎牛血清封板1 h，每孔接种不同浓度青龙衣膏处理24 h的细胞100 μl，细胞浓度为1×106个/ml，黏附60 min，磷酸缓冲液洗去没有黏附的细胞，加入新鲜培养基200 μl后，加入质量浓度为5 mg/ml的MTT溶液，培养箱内孵育4 h，取出，小心吸弃上清液，加入DMSO 150 μl溶解结晶。采用Safire2高速多通道波长酶标仪在570 nm波长处读取吸光值。细胞黏附率=实验组OD570/对照组OD570×100%。

2.3 青龙衣膏对胃癌细胞BGC-823侵袭能力的影响

在transwell小室上室铺人工基质胶模拟体内环境，结晶紫染色后计数穿过ECM的细胞数来代表细胞的侵袭能力。transwell上室均匀铺Matrigel基质胶，37 ℃放置过夜；消化细胞，上室每孔加入含1.5×105细胞的无血清培养基100 μl；下室中加入10%胎牛血清培养基600 μl；在上室每孔加入不同浓度药物，小心将细胞放入37 ℃培养箱中，孵育24 h；取出transwell吸出上室液体，甲醇室温固定30 min，用棉签擦去上室表面细胞，风干；加入0.1%的结晶紫染色30 min，缓慢冲洗倒置晾干，显微镜下(200倍)拍照，计数[4-5]。

2.4 青龙衣膏对胃癌细胞株BGC-823迁移能力的影响

用transwell侵袭小室模拟体内环境，结晶紫染色后计数穿过ECM的细胞数来代表细胞的迁移能力。方法与“2.3”相同，但上室不铺matrigel基质胶。

2.5 Western blot法检测青龙衣膏对胃癌细胞BGC-823环氧酶2(COX-2)蛋白表达的影响

COX-2过表达的细胞侵袭转移能力强。因此，COX-2表达可被作为检测细胞侵袭能力的指标。收集细胞，按照细胞浆蛋白提取试剂盒操作，提取细胞浆蛋白，定量，取蛋白30 μg上样进行10%的SDS-聚丙酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别用COX-2抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃下孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST缓冲液洗膜10 min×3次，曝光成像，凝胶分析软件进行灰度值分析，以目的基因与GAPDH基因条带积分的OD比值表示COX-2蛋白表达。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 青龙衣膏对胃癌细胞BGC-823生长增殖的影响

人胃腺癌BGC-823细胞经青龙衣膏各浓度作用24、48 h后，IC50分别为(1.3123±0.19)、(1.128±0.105) mg/ml，对肿瘤细胞增殖均表现为不同程度的抑制作用，并呈现一定的时间-剂量依赖关系，抑制曲线见图1。

图1 青龙衣膏对胃癌BGC-823细胞生长的抑制作用Fig 1 Inhibition of Qinglongyi electuary on the growth of gastric cancer BGC-823 cells

3.2 青龙衣膏胃癌细胞株BGC-823黏附能力的影响

通常，高侵袭能力的肿瘤常伴随细胞与细胞间黏附力的降低和细胞与胞外基质(ECM)间黏附力增强。故根据“2.1”结果，采用不明显影响细胞生长的浓度作为试验浓度。将细胞分为对照组、低剂量组(0.66 mg/ml)、中剂量组(0.74 mg/ml)及高剂量组(0.82 mg/ml)。结果显示，低、中及高剂量组经药物处理24 h后，BGC-823细胞黏附率分别为(88.39±2.51)、(90.23±7.27)及(81.37±2.0)%，对照组为100%，低、高剂量组明显低于对照组，差异有极显著统计学意义(P<0.01)，说明低、高剂量的青龙衣膏能显著抑制BGC-823细胞与ECM间黏附，见图2。

图2 不同浓度青龙衣膏对胃癌BGC-823细胞与ECM 间粘附能力的影响Fig 2 Effects of different concentrations of Qinglongyi electuary on adhesion between gastric cancer BGC-823 cells and ECM

3.3 青龙衣膏对BGC-823细胞侵袭能力的抑制作用

对照组，低、中及高剂量组经药物处理后，BGC-823细胞侵袭细胞数分别为(95±9.23)、(13±1.1)、(15.1±2.91)及(27.8±4.04)个，低、中及高剂量组的侵袭细胞数明显少于对照组，差异有极显著统计学意义(P<0.01)，表明不同剂量青龙衣膏能显著的抑制BGC-823细胞侵袭能力，见图3—4。

图3 青龙衣膏对胃癌BGC-823细胞侵袭能力的抑制作用Fig 3 Inhibition of Qinglongyi electuary on the invasion ability of gastric cancer BGC-823 cells

图4 侵袭穿过基底膜的细胞(×200倍)Fig 4 Cells that invade the basement membrane (×200)

3.4 青龙衣膏对BGC-823细胞迁移能力的抑制作用

对照组，低、中及高剂量组经药物处理后，BGC-823细胞迁移细胞数分别为(134±23.23)、(27.7±5.16)、(28.7±6.27)及(32±3.65)个，低、中及高剂量组迁移细胞数明显少于对照组，差异有极显著统计学意义(P<0.01)，表明不同剂量青龙衣膏能显著的抑制BGC-823细胞迁移能力，结果见图5—6。

图5 青龙衣膏对胃癌BGC-823细胞迁移能力的抑制作用Fig 5 Inhibition of Qinglongyi electuary on the migration ability of gastric cancer BGC-823 cells

图6 迁移穿过小室上室膜的细胞(×200倍)Fig 6 Cells that migrate through the ventricular membrane of the chamber (×200)

3.5 青龙衣膏对BGC-823细胞COX-2蛋白表达的影响

与对照组比较，低、中及高剂量组的COX-2蛋白表达水平明显下降，差异有极显著统计学意义(P<0.01)，表明青龙衣膏可明显抑制COX-2蛋白的表达，且随着剂量的增加，对COX-2表达的抑制作用增强，见图7。

图7 青龙衣膏对COX-2表达的影响Fig 7 Effects of Qinglongyi electuary on COX-2 expression

4 讨论

体内外实验结果表明，青龙衣对多种肿瘤有肯定的抗肿瘤效果[6-7]，并发现青龙衣能通过促进胃癌细胞凋亡[8-9]、抗肿瘤血管生成[10]及调节免疫[11]等多途径发挥抗肿瘤作用，在民间应用也有成功案例，但其对胃癌细胞侵袭能力的研究尚未见报道。本研究以自制青龙衣提取物的膏剂为研究对象，检测此青龙衣提取物对胃癌BGC-823细胞侵袭能力的影响。

肿瘤细胞与细胞外基质的黏附和侵袭在肿瘤转移过程中发挥重要的作用。采用Matrigel模拟体内基底膜最真实的体内环境，研究青龙衣提取物对胃癌BGC-823细胞与ECM的黏附与侵袭力能力。结果发现，与对照组相比，青龙衣提取物0.66、0.74及0.82 mg/ml处理后，胃癌BGC-823细胞与Matrigel的黏附能力明显降低，细胞的迁移和侵袭能力也显著降低(P<0.01)。表明青龙衣提取物可抑制胃癌侵袭能力。

环氧酶(COX)是前列腺素合成过程中重要的限速酶。在病理情况下，COX-2的高表达可诱导胃癌的侵袭和转移[12-14]。本研究中，青龙衣提取物可下调COX-2的表达，可能与其抑制BGC-823细胞的黏附和侵袭作用密切相关。

青龙衣的抗肿瘤疗效尚缺乏系统的近期疗效及远期疗效评价，也没有其抗肿瘤作用靶点的相关研究报道，应进一步挖掘其有效单体成分以及抗肿瘤作用机制[15]，并探索其在肿瘤靶向治疗方面的意义，充分挖掘其潜在的药用价值。