严晶 胡申才

摘要：近年来由于耐药菌的频频出现，抗生素在抗感染领域面临前所未有的挑战，目前研制可裂解病原菌的噬菌体制剂已为一大热点。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体在基因组复制晚期合成的一类蛋白质，它能够水解细菌细胞壁中的肽聚糖从而杀灭细菌。噬菌体裂解酶在体内外的试验中都表现出很高的杀菌性、种属特异性和安全性，因而具有广阔的应用前景。简要介绍了噬菌体裂解酶的结构性质，并对裂解酶显示出的抗菌性能及应用进行了综述。

关键词：噬菌体;裂解酶;耐药菌

中图分类号：S562         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）10-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.10.001           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： More recently， the original application of phage as therapeutics to treat human and animal infections has been rekindled， particularly in an era where antibiotic resistance has become so problematic. Bacteriophage lysins，which are peptidoglycan hydrolases encoded by double-stranded DNA bacteriophage， are produced in phage-infected bacterial cells toward the end of the lytic cycle. It was proved that the phage lysins exhibited high activity against bacteria， narrow antibacterial spectrum， and apparent safety in vitro and vivo experiments. Those paved solid foundation for further exploration of their application. A review on the structure and mode of action of lysins and their application were presented.

Key words： bacteriophage; lysin; antibiotic resistant bacteria

噬菌體（Bacteriophage，phage）是能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称[1]，据Brüssow[2]推算地球上大概有1032个噬菌体存在，这个数据大概是细菌数量的10倍。可以说，凡是有细菌分布的地方， 就会有噬菌体存在。噬菌体感染的最后一步就是水解细菌细胞壁释放成熟颗粒（丝状噬菌体除外）。单链DNA噬菌体通过合成干扰宿主细菌肽聚糖合成的酶而导致宿主菌胞壁的水解，而双链DNA噬菌体则可通过在复制晚期所合成的裂解酶（lysin或endolysin）来水解宿主菌的肽聚糖结构[3]。

1  裂解酶的结构和溶菌机制

裂解酶又称内溶素、溶胞壁酶，是一类细胞壁水解酶。它被应用到体外时，可以快速使革兰氏阳性菌裂解死亡[4]。多数噬菌体裂解酶具有“双结构域结构”的特点：N端结构域具有催化活性，能够特异地切断肽聚糖中的化学键，称为催化域CD。C端结构域可以识别和结合宿主细菌细胞壁上的特异性底物，称为结合域CBD[5]。还有一些裂解酶（如大多数分枝杆菌噬菌体裂解酶） 含有多个不同的催化结构域和1个结合结构域。另外，金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Hyd H5拥有2个催化结构域，却不含结合结构域[6]。而少数革兰阴性菌噬菌体裂解酶N端为结合结构域，C端为催化结构域。因为裂解酶的作用位点是细菌细胞壁上的肽聚糖苷键，且为高度保守的肽聚糖成分，且随着细菌进化，噬菌体也进化，使得细菌很难对裂解酶产生抗性[7]。

根据裂解酶催化结构域的作用位点，可粗略地将其分为胞壁酸酶（作用于胞壁上聚糖骨架中的β-1，4-糖苷键）、肽链内切酶（作用于多肽链） 或酰胺酶（水解聚糖骨架和多肽链之间的酰胺键）[8]。还有一些裂解酶可以作用于其他位点，例如分枝杆菌噬菌体裂解酶Lysin B可以水解分枝菌酸和肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖复合物间的化学键[9]。

裂解酶从细菌内部裂解细菌的方式称为“自内裂解”。将某些裂解酶加入到对其敏感的细菌中，在缺少噬菌体的情况下也能引起细菌裂解，则称为“自外裂解”，也就是说，该类噬菌体裂解酶在细菌外也能发挥快速、高效的溶菌作用。

裂解酶的活性和结构特点显示了其良好的抗菌作用，也使其在成为新型抗菌药物方面拥有广阔的前景。

2  噬菌体裂解酶的优势

2.1  不产生细菌抗性

基于相关抗菌药物，如抗生素的缺点，耐药性的超级细菌不断进化对其产生抗性，使得药物失效。在Nelson等[10]将化脓链球菌长时间暴露于含低浓度裂解酶的平板上，连续传代40次也不会产生抗性。同样，Loeffler等[11]将肺炎链球菌与低浓度裂解酶Pal混合，经过液体培养基中的10次传代，未出现抗性细菌。原理推测可能是Pal在肺炎链球菌上的作用位点是胆碱，胆碱对于肺炎链球菌的存活是必需的。推测噬菌体随着细菌共同进化，为了裂解宿主后脱离宿主，裂解酶的结合结构域针对宿主细胞壁受体分子，经演化后能够特异性识别细菌并杀死细菌，使细菌很难对其产生耐受性。

2.2  特异性介于抗生素和噬菌体之间

裂解酶的特异性相较于抗生素更好，相较于噬菌体，裂解谱又扩大了。研究发现，对青霉素耐药的肺炎链球菌菌株可以被裂解酶杀死，同时对人体的正常菌群没有影响，而抗生素在杀死病原菌的同时，也损伤了部分正常菌群。不仅如此，裂解酶的裂解谱却可以超出本身噬菌体的宿主谱，比如瑞士乳杆菌噬菌体Ф-0303的裂解酶Mur-LH[12]、无乳链球菌噬菌体B30的裂解酶和产气荚膜梭菌噬菌体Ф-3626的裂解酶Ply3626都可裂解多种同类细菌[13]。试验证明，具有酰胺酶活性的裂解酶还具有更宽的裂解谱，可以裂解不同类的细菌。据报道，人类致病菌粪肠球菌噬菌体Ф1的裂解酶PlyV12可能是裂解谱最广的，不但可以裂解同类肠球菌，如粪肠球菌和乳酸肠球菌，同时还可以裂解化脓链球菌、B群、C群链球菌和金黄色葡萄球菌等[14-17]。

2.3  裂解酶刺激产生的相关抗体不会削弱其杀菌作用

由于裂解酶是较大的蛋白分子，在其通过动物体内黏膜或经注射进入全身循环时有可能刺激产生免疫反应从而影响自身作用的发挥。但Loeffler等[11]发现抗体的产生不会影响裂解酶自身的杀菌作用。Cpl-1裂解酶的体外试验对肺炎链球菌作用的时候，产生的相关兔源高价免疫血清只会减缓不会阻碍其裂解作用。Cpl-1在小鼠体内的半衰期很短，为20.5 min，这导致1～2次应用Cpl-1不能完全清除小鼠体内的肺炎链球菌，之后感染会再次发生。在体内试验中，设置试验组为Cpl-1 3次静脉注射免疫的小鼠，对照组为未免疫的小鼠。用肺炎链球菌对小鼠静脉攻毒10 h后再注入Cpl-1解毒，结果发现在1 min内，试验组和对照组都使细菌滴度降低了相同的程度。

Rashel等[18]在金黄色葡萄球菌的体内试验中，用裂解酶phiMR11也得到了相同的结论。推测是因为裂解酶与细菌细胞壁的亲和力远比与抗体的强，可以通过在动物黏膜表面或血液中重复注入裂解酶控制病原菌的定殖。还有研究显示，对小鼠腹腔反复3次注射裂解酶MV-L以激活免疫反应，这样会使其血清中的抗体水平大幅度上升，但抗体对裂解酶的影响有限。如，在体外试验中，兔的高价免疫血清也只是对其活性产生一定限度的抑制;Rashel等[18]将金黄色葡萄球菌噬菌体？准MR11的裂解酶MV-L与鼠的免疫血清混合孵育1 h，也获得了同样的结论。Loessner等[19]的研究也显示出当针对结合结构域的特异性IgG存在时，李斯特菌裂解酶的结合结构域仍会与细菌细胞壁上的底物结合，这表明裂解酶对底物的亲和力高于其对抗体的亲和力。虽然这能够解释抗体不能中和噬菌体的结合结构域，但无法解释为何抗体无法中和催化结构域。

2.4  裂解酶的作用高效迅速

裂解酶在体外与细菌接触的瞬间迅速破裂细菌细胞，可使细菌浊度迅速下降[20]。对链球菌裂解酶ClyV的体外试验研究发现，25 μg/mL的裂解酶可以在15 min内使靶细菌的数量下降2个数量级。裂解酶在加入浑浊的细菌溶液后，短时间内以肉眼可见的速度下降其浊度。在细胞试验中，将停乳链球菌与肺上皮细胞A549共孵育一段时间后，用PBS溶液洗去细胞表面黏附的链球菌，再加入有效工作浓度的ClyR进行处理。裂解细胞后，对细胞内残存的靶细胞进行稀释平板计数，发现试验组的细菌数量降低了2个数量级。在体内试验中，裂解酶同样高效。尽管裂解酶在体内的半衰期很短，如Cpl-1的半衰期只有16 min，但Loeffler等[11]发现将肺炎链球菌通过静脉注射小鼠体内攻毒1 h后，注入2.0 mg的Cpl-1可使小鼠存活48 h，其中有1只小鼠在血中和组织中的病原菌已经消除。而对照组平均只能存活25 h，只有20%的小鼠可以存活48 h。短时间内裂解酶在体内外以及细胞胞内都发挥了杀菌作用。

2.5  裂解酶可与抗生素产生协同效应

2种酶共同使用可产生协同或竞争抑制作用。对裂解酶来说，无论是裂解酶之间或裂解酶与抗生素之间，都具有协同效应。Jado等[21]发现高浓度噬菌体Dp-1或高浓度裂解酶Cpl-1单独使用，或低浓度Dp-1和低浓度Cpl-1共同使用，都可以使小鼠全部存活，而Dp-1或Cpl-1单独使用时，因严重的菌血症小鼠全部死亡。故低浓度的酶和噬菌体的混合物可以发挥与高浓度的单酶相同的效果，酶与噬菌体之间具有协同效应。裂解酶与抗生素联用也可发挥协同杀菌作用。Djurkovic等[22]发现将裂解酶Cpl-1与庆大霉素联用，可降低青霉素对肺炎链球菌的最小抑菌浓度（MIC）。当Cpl-1与青霉素联用时，亦可以协同杀死对青霉素耐药的菌株。Rashel[18]也证明了裂解酶与抗生素之间的协同效应，将金黄色葡萄球菌裂解酶MV-L与糖肽类抗生素联用，很好地控制了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌的繁殖。裂解酶与抗生素的协同效应，为解决现阶段愈加严重的细菌耐药性问题提供了一种新思路。

3  裂解酶的改造

由于裂解酶具有种属特异性，且其结构域的特殊性使得酶的作用范围受到局限，因此将裂解酶进行多功能设计，满足广谱性和性能的优化。通过其结合结构域作用于细胞壁，水解细胞壁最终摧毁细胞，作用高效且不易产生抗性。根据裂解酶结构的模块化，人们不但可以通过合成生物学合成有不同应用能力的裂解酶，如通过混合排列重组天然裂解酶的功能结构域来改变种属特异性，提高广谱裂解酶的杀菌活性和可溶性;而且还可以将不同源的结构域和肽端连接起来进行融合表达，如将减稳肽和革兰氏阴性菌的裂解酶融合表达，可以将其杀菌活性延伸到革兰氏阴性菌。裂解酶及其他水解酶具有特殊的结构域，其作用方式及模塊都有所不同。如肺炎球菌噬菌体裂解酶的胆碱结构域发挥重要催化功能[23]，而金黄色葡萄球菌及乳球菌以细胞壁水解功能为主[24，25]，李斯特菌噬菌体裂解酶则以酰胺酶为主[26]。 虽然裂解酶因其结构功能的特性被分为不同类型，但其最根本还是以酰胺酶及内肽酶为主要作用形式。在这些酶中，有一类常见的蛋白家族CHAP，在作为催化结构域时其表现为酰胺酶活性也会表现出内肽酶的功能，在裂解过程中发挥重要作用。金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK及Φ11具有高度同源的N末端CHAP及酰胺酶结构域[27，28]，因此，将其CHAP作为主要催化基团，并加入特殊的细胞结合结构域（CBD）SH3b，将有望扩大其裂解功能[29]。李斯特菌噬菌体与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶裂解功能类似，也是通过催化切割N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺残基将宿主细胞壁裂解，其裂解酶CBD不仅有种属特异性，甚至有血清或菌株特异性[30]，因此，将其与金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的酰胺酶活性进行结合，其多功能活性将会同时作用于2种病原菌。另外，还可以对全长裂解酶进行截断处理，研究发现B族链球菌裂解酶PlyGBS的N端（GBS180）180氨基酸的杀菌活性比全长PlyGBS杀菌活性更好，但杀菌谱窄;而将其与广谱裂解酶ClyR的CBD融合在C端表达后，得到新裂解酶ClyE，在提高杀菌活性的同时，又拓宽了杀菌谱。不仅如此，ClyR[31-34]也是一个经嵌合改造的广谱裂解酶，是将来自B族链球菌裂解酶PlyC的N端147个氨基酸与猪链球菌裂解酶PlySs2的C端85个氨基酸嵌合而成。裂解酶结构域重构可以作为多功能酶蛋白构建的新方法[35]，而把裂解酶蛋白进行有效配比亦能获得复合裂解效果，也是获得广谱抗菌的新途径。工程嵌合裂解酶可以通过重组不同来源的结构域或分子融合来构建，这样嵌合体可能被赋予新的特性，包括结合特异性、杀菌谱、溶解性、稳定性、活性等[36，37]。这些嵌合裂解酶也在医疗、农牧业等多方面得到了应用。噬菌体裂解酶的单个或多个结构域也在诊断和免疫治疗中得到广泛应用[38，39]。此外，采用多肽等小分子进行联合构建等方法使酶谱扩大[40]，同样早期还有将酶与抗生素联用等发挥协同抗菌等的研究[41]，这些不仅能放大酶的作用同时也会降低抗生素的用量，都将给裂解酶产品的开发提供依据。

4  噬菌体裂解酶用于治疗的发展趋势

在抗生素逐渐对耐药菌株失效的困境下，可以筛选耐药菌的噬菌体，并将其产生的裂解酶单独用药或和抗生素等其他抗菌药物一起联合用药[42]，这扩大了裂解酶的广谱性，又避免了靶细胞的耐药性;另外，也可以通过分子生物学的方法改造噬菌体裂解酶，扩大其宿主谱，使其能够特异性裂解某一种属的细菌，甚至不同种属的细菌。从生物技术的角度来说，后一种方法更加切实有效， 因为研究者已经通过分子生物学的方法，相对容易地改造优化了裂解酶。其次，筛选、培育能在体内长期循环的噬菌体也是一大趋势。为延缓机体免疫系统对裂解酶的清除，延长裂解酶在体内存留时间，可以通过连续传代的方法来筛选那些发生变异后能在体内长期循环的噬菌体，从而生产其对应的裂解酶。

尽管裂解酶有很多优势，但仍存在很多问题：①有研究指出天然裂解酶在大肠杆菌中表达时有些对表达菌株具有明显的毒性，蛋白表达往往以包涵体的形式存在;②裂解酶本质是蛋白质，进入机体后易受到蛋白酶的攻击，而具有较短的半衰期;③很难掌握裂解酶在治疗过程中的最佳时间和最适剂量;④裂解酶治疗的宿主谱很窄等。

关于噬菌体裂解酶对细菌的杀菌效果的研究日益增多，如何长期地保存裂解酶、如何高效安全地给药、如何大量生产和应用裂解酶、如何评价裂解酶治疗的效用等难题有待解决[43]。运用分子生物学领域的技术方法，从基因水平改造噬菌体，使其携带一种甚至多种细菌的通用配体，扩大其宿主谱，提高现有噬菌体裂解酶的裂解能力，以及更换表达菌株使裂解酶在真核生物和细胞水平上表达是今后的研究方向。

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