张红波 李前琼 吕雪凤

【摘要】目的：建立灵芝养肝丸质量标准。方法：采用显微鉴别法对猪苓、大黄、赤芍、黄连、厚朴、甘草进行鉴别，用薄层色谱法对大黄、黄连进行鉴别;用高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量。结果：薄层色谱斑点清晰;芍药苷在0.06～1.8μg（r=0.9999）的范围内线性关系良好，平均回收率为98.41%（n=6），RSD为0.63%。方法精密度，重复性符合要求。结论：该方法结果准确可靠，适用于灵芝养肝丸的质量控制。

【关键词】灵芝养肝丸;薄层色谱法;高效液相色谱法;质量控制

【中图分类号】R284【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）8-0054-04

Abstract：ObjectiveToestablishthequalitystandardofGanodermalucidumliverpill.MethodsLingling，rhubarb，radixpaeoniae，Huanglian，Magnoliaandlicoricewereidentifiedbymicroscopicidentification，andrhubarbandHuanglianwereidentifiedbyTLC，andthecontentofPaeoniflorininRadixpaeoniaewasdeterminedbyhighperformanceliquidchromatography.ResultsTLCspotswereclear，thelinearrelationshipbetweenPaeoniflorinwasgoodintherangeof0.06～1.8μg（r=0.9999），theaveragerecoveryratewas97.98%（n=6），andtheRSDwas1.86%.MethodPrecision，repeatabilitymeettherequirements.ConclusionTheresultsofthismethodareaccurateandreliable，anditissuitableforthequalitycontrolofGanodermalucidumliverpill.

Keywords：GanodermaLucidumLiverPill;TLC;HighPerformanceLiquidChromatography;QualityControl

灵芝养肝丸为莱芜市中医医院制剂品种，具有疏肝利胆、行气化湿的功效，适用于脂肪肝、乙肝、胆系感染等症。灵芝养肝丸由17味药组成，组方复杂，原批准的质量标准较简单，达不到控制质量的目的。为了更好的控制药品质量，增加了对组方中猪苓、大黄、赤芍、黄连、厚朴、甘草的显微鉴别，大黄、黄连的薄层色谱鉴别和高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，从而较全面的反应包括投料在内的质量控制指标。

1仪器与材料

1.1仪器ShimadzuLC-20A高效液相色谱处理系统（日本）;梅特勒-托利多XS105DU电子分析天平（瑞士）;科哲生化薄层色谱成像系统;KQ-250DE超声波清洗器;BX-51奥林巴斯显微镜。

1.2材料灵芝养肝丸（批号：180524、180607、180620，莱芜市中医医院）;大黄（批号：120902-201311）;黄连（批号：120913-201611）;芍药苷（批号：110736-201842）对照药材与对照品均为中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1显微情况取本品适量，用水溶散，取沉淀物共装10个载玻片置显微镜下观察：菌丝散在或黏结成团，无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝（灵芝）。菌丝间有草酸钙方晶，大多呈正方八面体形等（猪苓）。草酸钙簇晶大，直径60～140μm（大黄）。导管群放射状排列，导管旁有木纤维（赤芍）。石细胞鲜黄色，单个或成群散在（黄连）。石细胞分支状，壁厚，层纹明显（厚朴）。纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维（甘草）。如图1～7所示。

2.2薄层鉴别

2.2.1大黄的TLC鉴别取本品0.6g，加甲醇20mL，浸渍1h，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水5mL溶解，再加盐酸0.5mL，置水浴上加热30min，立即冷却，用乙醚20mL，分2次（10mL、10mL）振摇提取，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供试品溶液。再取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。另取处方中除去大黄的其他药味，按处方比例制成缺大黄的阴性对照样品。取阴性对照样品2g，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液。分别取上述3种溶液各4μL，分别点在硅胶G薄层板上，石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙色荧光斑点;置氨蒸气中熏后，日光下检视，显相同的红色斑点。阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。如图8～9所示。

2.2.2黄连的TLC鉴别本品1g剪碎，加甲醇5mL，超声处理15min，滤过，滤液作为供试品溶液。再取黄连对照药材0.25g，同法制成对照药材溶液。另取处方中除去黄连的其他药味，按处方比例制成缺黄连的阴性对照样品。取阴性对照样品2g，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液。分别取上述三种溶液各2μL。分别点在硅胶G薄层板上，甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶2∶0.3）为展开剂，在另槽中加入等体积的浓氨试液，预平衡15min，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。如图10所示。

2.3含量测定

2.3.1色谱的条件C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）;速度：1.0mL/min;检测波长：230nm;进样量：10μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

2.3.2制备对照品溶液取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

2.3.3制备供试品溶液取本品10丸，剪碎，称取5g，精密称定，加入等量硅藻土，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4制备阴性对照溶液按处方比例制成不加赤芍药材的阴性样品，按照供试品溶液方法2.3.3制成阴性对照溶液。

2.4方法学的考察

2.4.1线性范围分别精密吸取浓度为0.06mg/mL的芍药苷溶液各2、5、10、15、20、30μL，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。以对照品的进样量为横坐标，对照品峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：y=88224x-8993.3，相关系数r=0.9999。试验结果表明，芍药苷进样量在0.06～1.8μg之间进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4.2仪器精密度试验精密吸取芍药苷对照品溶液（0.06mg/mL）5μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值。结果RSD为0.19%，表明仪器精密度良好。

2.4.3样品稳定性试验取样品（180524）照上述方法实验。每隔5h进样1次，每次5μL，测定芍药苷的峰面积积分值，共5次，结果RSD为0.50%，表明供试品溶液在25h内稳定性良好。

2.4.4方法重复性考察取同一批号（批号：180607）的样品6份，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，计算含量与RSD，结果表明，灵芝养肝丸供试品中芍药苷的含量为0.93mg/g。RSD为1.89%，表明含量测定方法的重复性良好。

2.4.5加样回收率试验取已测知含量的本品适量（批号：180607，芍药苷的含量为0.93mg/g），剪碎，取约2.5g，精密称定，加入等量硅藻土，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入芍药苷对照品溶液（浓度为：0.06mg/ml）40mL、甲醇10mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，计算。结果表明，测定方法的回收率良好。见表1。

2.4.6专属性试验将对照品溶液、样品溶液及阴性对照溶液，依次进行测定，按照“2.3.1”设定的色谱条件进行实验。图谱表明：阴性对照无相应色谱峰，可认为在此方法下该样品中其他组成部分对实验没有影响。结果如图11～13所示。

2.5样品测定取3批样品，按“2.3.3”项下方法得到的样品溶液，按照预设的条件进行实验，根据所得的峰面积得到样品中芍药苷的含量。结果见表2。

3讨论

实验参考药典方法[1]，分别采用显微鉴别法对猪苓、大黄、赤芍、黄连、厚朴、甘草进行鉴别，各品种特征明显可见。用高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，参考相关文献[6-9]，采用高效液相色谱法测定了赤芍中芍药苷的含量。考察了安捷伦1200、岛津LC-20A两种仪器和InertsilODS-3（4.6mm×150mm，5μm）;Agilent5TC-C18（4.6mm×150mm，5m）;AgilentEclipseXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm）3种色谱柱的影响。两种仪器和上述3种柱子由计算所得可知实验耐用性满足要求，该方法操作简便，样品中芍药苷峰与杂质峰完全分离，分析时间短，重现性良好。

根据相关资料[2-5]，进行大黄、黄连的薄层色谱法适用性试验，考察了不同的温湿度（16℃、26℃，32%、65%、88%）和薄层板（Merck、青岛海洋、烟台大学科工所、自制板），均得到了满意结果。该方法适用于灵芝养肝丸的测定。

参考文献

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（收稿日期：2019-02-11编辑：陶希睿）