杨翠萍 蔡琨 宣锦

【摘要】目的：探讨仙茅多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响。方法：采用不同浓度的仙茅多糖（500，250，125，62.5，31.25μg/mL）分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞和小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，36h后加入荧光标记的大肠杆菌，室温避光孵育1.5h，荧光显微镜下观察不同剂量的仙茅多糖对两类细胞吞噬大肠杆菌活性的影响。结论：仙茅多糖呈剂量依赖性增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能。

【关键词】仙茅多糖;巨噬细胞;RAW264.7细胞;吞噬活性

【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）8-0020-04

Abstract：ObjectiveTodiscusstheeffectsofcurculigoorchioidespolysaccharide（COP）onphagocyticactivityofmousemacrophages.MethodsTheprimaryperitonealmacrophagesofmiceandRAW264.7cellsofmousemacrophagecelllineweretreatedwithdifferentconcentrationsofFestucaarundinaceapolysaccharides（500，250，125，62.5，31.25μg/mL）respectively.After36hours，fluorescentlabeledEscherichiacoliwasaddedandincubatedatroomtemperaturewithoutlightfor1.5hours.Theeffectsofdifferentdosesofcitronellapolysaccharideonthephagocyticactivityoftwokindsofcellswereobservedunderfluorescencemicroscope.ConclusionCurculigoorchioidespolysaccharideenhancedthephagocyticfunctionofmousemacrophagesinadose-dependentmanner.

Keywords：CurculigoOrchioidesPolysaccharide;Macrophage;RAW264.7Cell;PhagocyticActivity

多糖是一类存在于动植物和微生物中的天然高分子化合物，具有重要的生物功能和宝贵的药用价值[1]。研究认为植物多糖普遍具有调节机体免疫功能的活性，尤其对机体非特异性免疫系统的调节效应比较显著[2-4]。仙茅（CurculigoorchioidesGaertn）是石蒜科多年生草本植物，其药用部位为根茎，其性温，入腎，肝经，主要功效有补肾助阳、益精血、强筋骨和行血消肿，主要用于肾阳不足、虚劳内伤和筋骨疼痛等病症[5]，仙茅多糖（Curculigoorchioidespolysaccharide，COP）是仙茅的水提醇沉部分，课题组前期研究发现仙茅多糖能调节小鼠免疫功能，也能通过增加小鼠巨噬细胞株RAW264.7分泌活性因子TNF-α和NO，促进巨噬细胞的活化[6-7]。巨噬细胞是机体内重要的非特异性免疫细胞，具有吞噬、清除病原体的，同时巨噬细胞也是许多多糖的主要作用靶细胞[8-9]。因此本实验拟将仙茅多糖分别作用于小鼠巨噬细胞株RAW264.7和小鼠腹腔原代巨噬细胞，探讨仙茅多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响。

1材料与仪器

1.1动物SPF级昆明种小鼠，雌性（雌性小鼠与雄性小鼠腹腔巨噬细胞的非特异性免疫功能没有差异），2月龄，体质量为18～22g，购自长沙天勤动物实验中心，合格证号：SCXK（湘）2014-001，饲养于实验室独立送风饲养笼具中。

1.2细胞株小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库（编号：KCB200603YJ）。

1.3试剂仙茅药材购买于贵阳市万东桥药材市场，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为仙茅CurculigoorchioidesGaertn的根;荧光标记大肠杆菌（V6694）购买于美国BD公司;DAPI溶液（C0065）、抗荧光衰减封片剂（S2100）购买自北京索莱宝科技有限公司。营养肉汤培养基（070912）购买于上海中科昆虫生物技术开发有限公司。

1.4仪器CO2培养箱（NewBrunswickGalaxy170s），荧光倒置显微镜（OLYMPUSU-RFL-T），生物安全柜（HaierHR60-HA2）。

2方法

2.1仙茅多糖的制备及浓度配置参照文献[10]制备仙茅多糖，仙茅根块晒干粉碎后用75%～80%的乙醇脱脂处理后风干打粉。称取5g干粉溶解于175mL蒸馏水中，于95℃水浴加热提取150min。抽滤并收集滤液，残渣按上述方法重复提取2次。滤液合并，减压浓缩至一定体积后，加入终体积分数不低于80%食用酒精沉淀。抽滤后沉淀物分别用90%酒精和丙酮洗涤，真空干燥后采用苯酚法测定其中多糖的含量为50%。仙茅多糖用无血清DMEM培养基中配制成浓度为500μg/mL的母液，滤菌后4℃保存，实验时用DMEM培养基稀释即得。

2.2RAW264.7细胞培养用含10%胎牛血清DMEM培养基（含青霉素1×105U/L、链霉素1×105U/L，pH7.2～7.4）置于5%CO2、37℃条件下培养。细胞传至第3代，通过细胞形态学观察，3～6代细胞用于实验。

2.3小鼠腹腔原代巨噬细胞提取参照文献[11-12]提取小鼠腹腔原代巨噬细胞，实验前3天给小鼠腹腔注射5%淀粉营养肉汤，每只小鼠注射1mL、每天注射1次。干预结束后，小鼠脱颈处死并用75%酒精消毒，在无菌条件下，充分暴露小鼠腹部肌层，腹腔注入10mL含双抗的DMEM培养基，轻揉腹部5min，然后吸取小鼠腹腔细胞悬液，移入离心管中，离心3000r/min，5min，用预冷PBS洗2次;得到细胞接种于24孔板，每孔接种细胞106个，共18孔，培养4h细胞贴壁，用预冷PBS洗2次，即得小鼠腹腔原代巨噬细胞。

2.4细胞培养及处理将RAW264.7细胞和小鼠腹腔原代巨噬细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁后，吸弃上清，分别加入含不同浓度仙茅多糖的DMEM培养基，使仙茅多糖浓度为500，250，125，62.5，31.25，0μg/mL，每组设3个平行孔，分别刺激36h。

2.5巨噬细胞吞噬荧光标记大肠杆菌培养结束后，吸弃上清，预冷PBS洗2次，加入以双蒸水200倍稀释的荧光标记大肠杆菌溶液（1mL/孔），室温避光孵育1.5h。干预结束后，吸弃上清，台盼蓝染色5min，PBS洗5次，每次3min，加入4%多聚甲醛固定细胞。最后以DAPI染核5Smin，取出爬片盖于载玻片上，滴加抗荧光衰减封片剂并封片，于荧光倒置显微镜下观察。

2.6巨噬细胞吞噬百分率玻片于荧光倒置显微镜下观察200个细胞，记录吞噬荧光标记大肠杆菌的巨噬细胞数量;吞噬百分率（PP%）=200个巨噬细胞内吞噬荧光标记大肠杆菌的巨噬细胞数量/200个细胞巨噬细胞总数×100%。

2.7统计学分析应用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间采用单因素方差分析进行显著性检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3结果

3.1仙茅多糖对RAW264.7细胞吞噬作用的影响如图1所示，各组RAW264.7细胞吞噬荧光标记大肠杆菌后，细胞形态轮廓清晰，形状呈圆形或椭圆形。正常对照组明显可见RAW264.7细胞有吞噬荧光标记大肠杆菌;与正常对照组比较，仙茅多糖组细胞吞噬荧光标记大肠杆菌明显较多。表1所示，仙茅多糖组细胞吞噬百分率都比正常对照组细胞吞噬百分率显著性增高（P<0.01），仙茅多糖在浓度为31.25～500μg/mL范围内能增强RAW264.7细胞吞噬能力，且呈现出良好的量效关系。提示仙茅多糖能增强RAW264.7细胞的吞噬功能。

3.2仙茅多糖对小鼠腹腔原代巨噬细胞吞噬作用的影响如图2所示，小鼠腹腔原代巨噬细胞吞噬荧光标记大肠杆菌后，细胞形态轮廓清晰，形状呈圆形或椭圆形。正常对照组明显可见小鼠腹腔原代巨噬细胞有吞噬荧光标记大肠杆菌;与正常对照组比较，仙茅多糖组细胞吞噬荧光标记大肠杆菌明显较多。表2所示，仙茅多糖125～500μg/mL组细胞吞噬百分率都比正常对照组吞噬百分率显著性增高（P<0.05或P<0.01），仙茅多糖在浓度为125～500μg/mL范围内可以增强小鼠腹腔原代巨噬细胞吞噬荧光标记大肠杆菌的能力，且呈现出较好的量效关系。提示仙茅多糖能增强小鼠腹腔原代巨噬细胞的吞噬功能。

4讨论

巨噬细胞在正常机体的免疫防御过程中扮演着重要的角色，参与机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节等过程，是机体非特异性免疫防御的关键环节。由于小鼠和人具有同源性，许多学者以小鼠来源的巨噬细胞作为细胞模型研究人类巨噬细胞生理、病理免疫反应。研究表明不同来源的巨噬细胞在复杂微环境中，其细胞形态、功能、表型会产生一系列复杂的变化[10]。所以，体外研究不同来源的小鼠巨噬细胞对了解人体巨噬细胞免疫反应（如吞噬、细胞因子分泌）具有重要意义。小鼠腹腔原代巨噬细胞是通过无菌性炎症刺激获取的，此细胞很好地保留了外周巨噬细胞的许多生理学特性，是比较接近生理状态的巨噬细胞。巨噬细胞株RAW264.7细胞源自Abelson鼠科的腹腔巨噬细胞，是一种白血病病毒诱导的肿瘤细胞，其生理状态、某些基因或细胞因子表达（其sIg-，Ia-、Thy1.2-表面抗原阴性）发生了改变，采用此细胞不可避免的会影响实验结果的准确性。因此，本实验采用不同来源的小鼠巨噬细胞，以求更准确的探讨仙茅多糖对巨噬细胞吞噬活性的影响。结果表明，仙茅多糖能增强这兩种不同来源的小鼠巨噬细胞的吞噬功能，并且呈剂量依赖性增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能。

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（收稿日期：2019-03-01编辑：刘斌）