达成利 帕拉提·艾斯卡 比力克孜·玉素甫

涎腺腺样囊性癌(salivaryadenoid cystic carcinoma，SACC)由于其浸润性极强，极易发生经神经侵袭转移和血运转移，转移率可高达40%[1-2]。ACC难以依靠手术彻底清除，预后往往不佳，因此寻找涎腺腺样囊性癌发生、发展中存在表达异常的关键因子对早期诊断、预后判断并指导治疗有着重要的意义[3-4]。趋化因子配体(CCL5)属于 CC 类趋化因子家族，主要表达于T细胞、巨噬细胞、特定的肿瘤细胞等，在肿瘤和炎性疾病中发挥重要作用[5-6]。李添翼等在体外细胞实验中证实趋化因子CCL5和其受体CCR5结合后可以促进SACC细胞的运动和侵袭能力，推测CCL5/CCR5生物轴与SACC侵袭与预后密切相关[7]。本研究旨在观察CCL5在SACC患者肿瘤组织和血清中的表达情况，探讨其在SACC的侵袭转移过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集我院2013年至2018年经手术切除、病理确诊、临床资料较完整的SACC患者76例作为观察组，收集术前血清样本、手术中肿瘤组织和癌旁腮腺组织病理切片。32例于我院体检中心体检并确认为健康人群的受试者为健康对照组。排除标准:①术前的治疗影响本研究结果(包括放疗、化疗);②伴有其他严重器质性疾病。2组观察对象年龄、性别、吸烟及饮酒史差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。所有患者均签署知情同意书。

表1 2组观察对象一般资料比较

1.2 主要试剂与仪器

试剂：兔抗人单克隆CCL5、CCR5 IgG抗体购自上海拜力生物科技有限公司，HRP标记山羊抗兔IgG抗体购自上海碧云天技术研究所，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，CCL5 ELISA检测试剂盒购自上海群己生物科技有限公司。仪器：高转速冷冻离心机(美国Thermo Scientific)，450 nm酶标仪(美国雷杜RT-6000)，倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)。

1.3 免疫组织化学法染色CCL5、CCR5蛋白

SACC组织切片10%甲醛固定，常规脱蜡、水化组织切片，3%双氧水消除内源性过氧化物酶37 ℃孵育10 min，血清封闭，兔抗人CCL5、CCR5一抗4 ℃孵育过夜，山羊抗兔二抗37 ℃孵育5 min，DBA显色，苏木精复染，脱水，干燥封片。显微镜下观察见棕黄色颗粒者为阳性表达。每张切片随机选取10个高倍视野(10×40倍)观察，对阳性细胞进行计数，据Bee-asley免疫染色评分方法[8]，按阳性细胞所占百分判断分级：阳性细胞数>50%为强阳性(+++)，>25%～50%阳性(++)，0～25%为弱阳性(+)，无明显着色阳性细胞为阴性(-)。

1.4 ELISA法检测血清CCL5水平

术前留取受试对象5 ml血液，室温放置4 h后离心20 min取上清置于-80 ℃保存。采用ELISA法检测血清中CCL5的含量：参照说明书加样于反应孔中后37 ℃孵育2 h，洗板，加入新鲜配置的酶标抗体100 μl 37 ℃ 孵育1 h，洗板后加入临时配制的TMB底物溶液100 μl 37 ℃避光显色20 min，终止显色。450 nm波长下测量各孔OD值，根据标准曲线的回归方程式计算CCL5的含量。

1.5 统计学方法

使用SPSS 18.0进行统计学分析。本研究中，CCL5和CCR5的表达以率表示，组间差异采用χ2检验；CCL5、CCR5水平在观察组和对照组中表达水平差异、观察组中CCL5水平与临床病理特征的关系采用单因素t检验；CCL5和CCR5相关性采用Spearman相关分析。P<0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCL5及其受体CCR5在SACC肿瘤组织和癌旁组织的表达

CCL5、CCR5主要表达于SACC肿瘤细胞的细胞膜、细胞质中，少量可见细胞核染色，呈淡黄色至棕黄色不等。SACC肿瘤组织中CCL5和CCR5表达水平明显高于癌旁组织，且差异均具有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 CCL5、CCR5在SACC肿瘤组织和癌旁组织的表达/例

2.2 CCL5在2组受试者血清中表达水平的比较

观察组血清中CCL5的表达量为(8.43±1.36) ng/ml，明显高于对照组(1.11±0.78)ng/ml，差异有统计学意义(t=20.125,P<0.001)。

2.3 SACC患者CCL5血清水平在不同临床病理参数间的比较

不同肿瘤发生部位的患者血清中CCL5水平间差异无统计学意义(P>0.05)；不同组织学分型、淋巴结转移情况、肿瘤TMN分期间进行血清CCL5水平比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。CCL5血清水平组织学分型腺管型者高于实体型者，淋巴结转移者高于无淋巴转移者，TMN分期中T3+T4高于T1+T2，见表3。

表3 SACC患者不同病理参数间CCL5血清水平的比较

2.4 SACC患者CCL5血清水平与肿瘤组织表达CCL5、CCR5的相关性

Spearman等级相关结果提示血清CCL5水平与肿瘤组织中CCL5蛋白表达呈正相关(γ=0.742,P<0.001)，与肿瘤细胞中CCR5蛋白表达亦呈正相关(γ=0.799,P<0.001)。

3 讨论

肿瘤的生长、浸润和转移受到肿瘤周围微环境复杂的调控和影响，肿瘤组织亦通过分泌一系列细胞因子进行交互性“对话”，从而让诱导、募集宿主免疫细胞至肿瘤局部，促进肿瘤恶性进展过程[9]。CCL5作为趋化因子家族的一员，可通过循环与其远处受体相结合发挥作用，因此在肿瘤转移中起到重要作用[10]。目前有研究发现，CCL5血清水平和胃癌患者肿瘤分期及疾病进展相关，可能成为预测胃癌预后的分子标志[11]，然而CCL5与SACC的临床相关性研究尚缺乏。本研究检测了SACC肿瘤组织和癌旁组织CCL5及其受体蛋白表达水平、SACC患者和健康对照者的CCL5血清水平，从而了解CCL5与SACC肿瘤病理特征及生物学行为的关系。

CCL5是肿瘤细胞中表达的主要趋化因子之一，具有招募并调节炎性细胞活性、诱导肿瘤的免疫耐受、协助肿瘤细胞的浸润和转移的能力[12]。近年来报道证实CCL5通过其特异性高亲和力受体CCR5结合，可引起下游一系列效应物的活化并产生相应级联反应，从而介导多种实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤的疾病进展[13-14]。通过基因敲除CCL5，调节性T细胞(regulatory cells，Treg)减缓了向肿瘤组织聚集的速度，免疫抑制作用减轻，从而有效改善了肿瘤细胞的免疫逃逸[15]。另一方面，有学者证实向载瘤裸鼠体内注射CCL5中和抗体阻断CCL5的体内作用，可以使肿瘤的生长速度被减缓，减少肺部转移灶的出现[16]。

本研究发现，相对于癌旁组织，SACC肿瘤组织中CCL5和CCR5表达水平明显升高(P<0.001)，且SACC患者CCL5血清表达水平显著高于相对于健康对照组(P<0.0001)，提示CCL5非仅仅在局部发挥作用。我们进一步探究SACC患者CCL5血清水平与不同临床病理因素的关系中发现：不同肿瘤发生部位的患者血清中CCL5水平间差异均无统计学意义(P>0.05)；不同组织学分型、淋巴结转移情况、肿瘤TMN分期间有差异(P<0.05)。具体结果为组织学分型为腺管型者高于实体型，淋巴结转移者高于无淋巴转移者，TMN分期中T3+T4高于T1+T2。结合免疫组合和ELISA结果进行相关性分析，结果提示血清CCL5水平与肿瘤组织中CCL5蛋白表达呈正相关(γ=0.742,P<0.001)，与肿瘤细胞中CCR5蛋白表达亦呈正相关(γ=0.799,P<0.001)。朱永云等[12]在乳腺癌相关研究中获得了类似的结果，证实CCL5是乳腺癌预后重要影响因素，提示CCL5 表达水平有可能作为SACC癌患者判断预后的潜在指标。

综上所述，CCL5血清浓度及组织表达水平可能成为SACC患者早期诊断及预后判断的重要分子标志，尤其是通过血清表达水平的监测可在术前获得无创的预后评估，在未来SACC治疗中具有广阔的应用前景。