毛跟年, 丁顺军, 夏 娟, 祁旭平, 梁毅廷, 梁承远*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.广东医科大学附属医院 血液病科， 广东 湛江 524023)

0 引言

棉酚(如图1所示)又名棉毒素或棉籽醇，是一种多酚双萘醛类化合物，存在于锦葵科植物棉花的根、茎和种子中[1].1886年由Longmore 和Marchlewski首次发现，1889 年第一次从棉籽中提取棉酚，1938年阐明其化学结构，棉酚分子质量为518.194 1，分子式为(C30H30O8)[2,3].上世纪80年代科学家发现棉酚具有抗生育作用，逐渐被人们熟知[4]，后又临床用于治疗女性激素依赖性疾病，包括子宫内膜异位症、子宫肌瘤、功能失调性子宫出血和痛经等.通过对棉酚的深入研究发现，棉酚具有多种生物活性，如抗炎、抗疟、抗病毒及抗氧化等，尤其是具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力[5,6].

图1 棉酚的结构

棉酚是手性化合物，存在两种对映异构体：棉酚(+)和棉酚(-)对映体[7]，棉酚光学稳定性差，在光照下，单一构型的棉酚在外消旋作用下，很快转化为1∶1比例的非对映异构体混合物[7].棉酚结构中6-OH、8-CHO和1- OH能发生互变异构，存在三种互变异构体[8](如图2所示)，棉酚固态条件下主要是双醛式对映体，当其溶于氯仿、苯、丙酮等溶剂时，氢谱结果显示只有醛式对映体存在；棉酚在高氢键接受质子的溶剂(DMSO)中主要以双醇酮式和双内醚式存在[9,10]；三种互变异构体的相互转化是棉酚化学反应较为复杂的主要原因，也为棉酚结构修饰提供化学基础.

图2 棉酚肉桂酸酯的结构

棉酚8，8′位的醛基与细胞毒性有关[11]，本研究希望棉酚在高氢键接受质子的溶剂转化为双醇酮式互变异构体[9,10]，其结构中醇羟基与酸进一步酯化，通过结构修饰增强棉酚的光学与化学稳定性，减少互变异构，进而降低棉酚的细胞毒性.肉桂酸是常见的化学合成砌块，本身具有抗氧化、自由基清除和抗肿瘤作用[12]与棉酚通过酯化反应结合后不仅可以作用于细胞色素P450酶系，降低棉酚细胞毒性，还可以保留较强的棉酚生物活性，也为棉酚结构衍生化提供了新思路和新途径.

在合成棉酚肉桂酸酯过程中，利用薄层色谱法(TLC)对新化合物做定性鉴别，并通过核磁波谱解析技术对其结构作进一步的确证.生物实验中以伊马替尼(如图3所示)为阳性对照，使用CCK-8法初步筛选新合成的棉酚衍生物对3种人类白血病细胞株(HL-60、Jurkat和K562)的抗白血病活性，为进一步探讨其抗白血病作用机制提供生物基础.具体的棉酚肉桂酸酯合成过程如图4所示.

图3 伊马替尼的结构

图4 棉酚肉桂酸酯合成

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 试剂

棉酚 (南京康满林化工实业有限公司)，肉桂酸(武汉远成共创科技有限公司)，二氯亚砜(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，石油醚(分析纯)，甲醇(分析纯)，三乙胺(分析纯)，氘代DMSO(Sigma-Aldrich)，CCK-8试剂盒(Med Chemexpress LLC)，HL-60(人原髓细胞白血病细胞)、Jurkat(急性T细胞白血病细胞)、K562(慢性粒细胞白血病细胞)(细胞系均由广东医科大学附属医院提供)，胎牛血清(上海麦克林生化科技有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(美国HBC Chem,Inc东方科技公司) SDS(Sigma-Aldrich)，RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich) .

1.1.2 仪器

磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)，加热套(江苏近湖教学仪器厂)，旋转蒸发其(RE52CS-1，上海亚荣生化仪器厂)，循环水多用真空泵(SHB-3A，南京大卫仪器设备有限公司)，流式细胞仪(德国Sysmex Partec，Dickinson and Company)，CO2培养箱 (上海力申科学仪器有限公司)，96孔培养板 (青岛金典生化器材有限公司)，超净工作台 (上海沪净医疗器械有限公司厂).

1.2 棉酚肉桂酸酯合成

1.2.1 肉桂酰氯合成

称取肉桂酸35 mg，二氯甲烷(除水)溶解，加入1 mL二氯亚砜(新制)，室温搅拌反应，TLC检测监测反应终点，反应完全，减压浓缩，除去溶剂和过量的二氯亚砜，得肉桂酰氯36.2 mg，收率为91.4%.

1.2.2 棉酚肉桂酸酯合成

称取棉酚102.3 mg，加入三口烧瓶中，搅拌并逐滴加入10 mL乙腈、三乙胺(10∶0.1)混合溶液，在氮气保护下常温搅拌反应0.5～1 h，加入新制肉桂酰氯36.2 mg，补加10 mL乙腈，升温至70 ℃搅拌反应约8 h，TLC追踪至反应终点.停止搅拌撤去加热装置，静置析晶，抽滤，乙腈洗涤滤饼三次，干燥即得棉酚肉桂酸酯精品(黄色固体)105.8 mg，收率为92.2%.

1.3 衍生物活性测试

1.3.1 CCK-8

CCK-8可以用于细胞增殖和毒性分析.其基本原理为该试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析.

1.3.2 溶液配制

1% w/v SDS溶液配制：组份浓度， 10%(W/V)SDS，配制量:100 mL.具体配制方法如下:

(1)称量10 g高纯度的SDS置于100～200 mL 烧杯中，加入约80 mL的去离子水，68 ℃加入溶解；

(2)滴加浓盐酸调节pH值至7.2；

(3)将溶液定容至100 mL后，室温保存.

1.3.3 对照药物和待测药物配制方法

用生理盐水配制伊马替尼溶液和棉酚肉桂酸酯溶液，使药物最终浓度均为3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L六种浓度.

1.3.4 细胞株类型和培养方法

(1)细胞株类型：HL-60(人原髓细胞白血病细胞)、Jurkat(急性T细胞白血病细胞)、K562(慢性粒细胞白血病细胞).

(2)培养方法：细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养于37 ℃细胞培养箱内，培养箱内湿度饱和，CO2浓度为5%.悬浮细胞每3天处理一次，保证细胞正常的悬浮生长状态.

1.3.5 细胞增殖试验

(1)接种细胞悬液100μL于96孔板，预先置于37 ℃，CO2(5%)饱和湿度的培养箱内培养；

(2)在每孔内加入10μL的CCK-8试剂；

(3)把培养板放培养箱内1～6 h(根据细胞类型与测试时间有所不同)；

(4)在450 mm波长处测定吸光值，参比波长为600 nm或以上波长.

1.3.6 测试方法

细胞培养至对数生长期时进行实验.具体方法如下：

将处于对数生长期的细胞制备成约为5×104个/L的细胞悬液，每孔加入100μL 细胞悬液接种于96孔板中，24 h后分别加入100μL含不同浓度棉酚肉桂酸酯的培养液.分为对照组(常规培养)、实验组(0.1 g·L-1、0.2 g·L-1、0.3 g·L-1和0.4 g·L-1)、GPS处理组(每组设5个复孔).在72 h时进行CCK-8比色实验.处理结束前4 h，每孔加CCK-8溶液10μL，继续培养4 h后，在450 nm处进行吸光度A测定.根据式(1)计算各实验组抑制率，进一步对实验结果进行分析.此实验重复3次.

(1)

2 结果与讨论

2.1 结构鉴别

棉酚肉桂酸酯核磁数据(图5)如下：1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:10.05(2H,s,C6、6′-OH),8.86(1H,s,C11-OH),8.50(1H,S,C11′-OH),7.49(4H,d,C20、21、23、24-H),7.33(2H,d,C17、18-H),7.23(2H,s,C4、4′-H),6.98(1H,s,C22-H),6.89(1H,S,C11′-H),3.75(2H,s,C1、1′-OH),2.20(2H,d,C13、13′-H),2.09(6H,s,C3、3′-CH3),1.45(12H,s,C13、13′-CH3);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:178.6(C7、7′),174.7(C11′),170.3(C6、6′),157.9(C1、1′),157.2(C16),147.9(C18),1 415.2(C11),137.8(C3、3′),137.2(C10、10′),135.2(C19),133.7(C5、5′),128.6(C20、21、23、24),127.9(C22),125.5(C2、2′),124.8(C8),119.6(C4、4′),117.3(C9、9′),116.2(C8′),115.5(C17),26.8(C13、13′),22.5(C14、15、14、15′),19.4(C12、12′).MS(ESI); found,649.3.

图5 棉酚肉桂酸酯1H-NMR图

2.2 棉酚肉桂酸酯抗白血病活性分析

本实验对合成所得到的棉酚肉桂酸酯作用于3种人类白血病细胞株(HL-60、Jurkat和K562)的体外抗肿瘤活性进行研究，采用标准的Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)法，本实验阳性对照为已上市抗白血病药物伊马替尼(如图3所示).

根据图6实验结果显示，棉酚肉桂酸酯对Jurkat细胞系体外增殖抑制活性，当化合物浓度低于12.5μM时，棉酚肉桂酸酯对Jurkat细胞系体外增殖呈现低浓度促进作用，与对照组相比浓度为3.125μM和6.25μM细胞数明显增加(如图7所示)；当化合物浓度高于25μM时，对Jurkat细胞系体外增殖呈现抑制作用，且随化合物浓度增加抑制率逐渐增加，随药物浓度的增加细胞死亡数目明显增加(如图7所示)；当化合物浓度为100μM时，对Jurkat细胞系体外抑制率最高为85.073%.棉酚肉桂酸酯对HL-60细胞系体外增殖抑制活性， 当化合物浓度低于12.5μM时，对HL-60细胞系体外增殖抑制作用没有明显增加，3.125μM和6.25μM的药物浓度下，细胞数量没有明显减小(如图7所示)；当化合物浓度高于25μM时，随浓度增加对HL-60细胞系体外增殖抑制作用呈明显增加，细胞数量随药物浓度增加逐渐减少(如图7所示)；当化合物浓度为100μM时，对HL-60细胞系体外抑制率最高为82.005%.棉酚肉桂酸酯对K562细胞系体外增殖抑制活性，随浓度增加，棉酚肉桂酸酯对K562细胞系体外增殖抑制作用逐渐增强，当化合物浓度为100μM时，对K562细胞系体外抑制率最高为94.191%.当棉酚肉桂酸酯浓度达到25μM，棉酚肉桂酸酯对3种细胞的抑制作用效果相同；当浓度增加为50μM时，棉酚肉桂酸酯对Jurkat细胞系的抑制作用强于对HL-60 和K562的抑制作用；当浓度增加为100μM时，棉酚肉桂酸酯对K562细胞系的抑制作用强于对HL-60和Jurkat的抑制作用.

(a)棉酚肉桂酸酯对Juekat抑制率随浓度变化曲线

(b)棉酚肉桂酸酯对HL-60抑制率随浓度变化曲线

(c)棉酚肉桂酸酯对K562抑制率随浓度变化曲线图6 棉酚肉桂酸酯对3种白血病细胞系体外抑制率随浓度变化曲线

棉酚肉桂酸酯对Jurkat、HL-60和K562细胞系体外增殖抑制活性小于对照药物伊马替尼(如表1所示)，当棉酚肉桂酸酯浓度分别为41.71μM和33.64μM时对HL-60和K562细胞增殖抑制率达到50%；其对Jurkat细胞表现为抑制增殖作用，当棉酚肉桂酸酯浓度为25.83μM时，对Jurkat细胞增殖抑制率达到50%.综合实验结果分析表明棉酚肉桂酸酯对3种人类白血病细胞株(HL-60、Jurkat和K562)的抑制作用表现为浓度依赖型，相比与上市药物伊马替尼的作用弱.

表1 棉酚肉桂酸酯对3种白血病细胞系的体外抗增殖活性

本实验对照药物伊马替尼(imatinib)是酪氨酸激酶抑制剂，能选择性地抑制Bcr-Abl蛋白的酪氨酸激酶活性，从而阻断多条信号传导途径，达到治疗白血病的目的[13,14].此外，该药还能抑制c-Kit、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、ARG等受体型酪氨酸激酶活性，从而起到抗瘤作用[14-17].而以往研究显示，棉酚能抑制Bcl-2蛋白的过度表达，引起细胞器功能丧失和增加凋亡因子的释放，促使细胞凋亡[18-20].肉桂酸具有抗氧化和清除自由基作用，同时可作用于促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，PI3Ks，NF-κB多个靶点发挥抗肿瘤作用[12].由此初步推测，棉酚肉桂酸酯可能是通过干预凋亡相关蛋白的表达来促进细胞凋亡，同通过作用于氧化应激防止白血病细胞增殖.鉴于在Jurkat细胞系中，棉酚肉桂酸酯与阳性药伊马替尼的活性最为接近，未来可通过对棉酚肉桂酸酯抗肿瘤机制进一步探究，有望成开发为温和治疗急性T细胞白血病的新型药物.

3 结论

本实验对棉酚进行结构改造，得到的新化合物棉酚肉桂酸酯，通过CCK-8法，对3种人类白血病细胞株(HL-60、Jurkat和K562)进行体外抗肿瘤活性研究.结果表明，棉酚肉桂酸酯对三种细胞都表现为浓度依赖型，对HL-60和K562细胞抑制作用比对照药物伊马替尼弱，对Jurkat细胞抑制作用较强，上述结果表明棉酚与肉桂酸酯化后具有较好的抗白血病效果，可作为先导化合物进一步研究其作用机制，有望成为一种抑制不同白血病亚型的低毒候选药物.另一方解决了棉酚互变异构的问题，具有更好的光学和化学稳定性，有利于成药.

图7 棉酚肉桂酸酯对3种白血病细胞系体外抑制