李冰,李玉双,*,陈琳,魏建兵,史荣久,宋雪英,周纪东,侯永侠,刘厶瑶

1.区域污染环境生态修复教育部重点实验室,沈阳大学环境学院,沈阳 110044

2.污染生态与环境工程重点实验室,中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016

0 前言

城市化是当前中国社会经济发展的重要过程,伴随着城市化的快速推进[1],土地利用的格局、深度和强度不断发生变化,与城市化相关的土壤环境质量问题日益凸显,这可能会对城市的生态安全及居民的身体健康造成影响[2]。

土壤酶与土壤质量密切相关,是土壤中具有生物活性的蛋白质[3],参与土壤生态系统中进行的诸多重要的物质转化和能量代谢过程[4-5]。大量研究表明,土壤酶活性具有综合性、生物性和动态性特点,易受环境中物理、化学及生物因素的影响,可以反映土壤的状态和动态变化[6]。因此,土壤酶的活性变化成为国内外学者开展土壤环境质量研究的重要对象[7]。土壤脲酶是土壤中最为活跃的水解酶类之一,能催化土壤中的尿素水解生成氨和CO2[8-9],其活性可以反映土壤的供氮能力,在土壤氮素循环中具有重要的作用[10]。不同来源的脲酶虽然其单体结构有所不同,但通常都具有高度保守的氨基酸序列[11-12],使其具有十分相似的三维结构和催化机理,催化底物专一,可以有效排除土壤反应体系中的干扰因素[13]。有研究表明,土壤脲酶动力学参数与土壤理化性质密切相关,将其活性作为土壤肥力水平的评价指标,具有一定的可靠性[14-15]。土壤微生物是土壤脲酶的重要来源,因此脲酶活性在一定程度还受到土壤微生物的影响[16]。而土壤微生物的组成和结构对各种人为扰动具有敏感的响应[17-18]。

城市化进程中,伴随着土地利用方式的改变,人为扰动强度增加,土壤理化性质和土壤微生物的组成结构也会发生相应变化。如迟旭雯[19]等研究发现,黑土由旱田改水田后,土壤pH 升高;陈超等[20]研究结果表明,林地有机质含量显著大于草地和农田;章家恩等[21]研究表明6 种不同土地利用方式下土壤微生物数量和多样性具有显著差别;彭木等[22]研究结果显示农田土壤的细菌数量大于林地土壤;还有文献报道农田土壤脲酶活性高于草地和林地[23]。这些研究表明,土壤理化性质和土壤微生物对土地利用方式具有敏感的响应,这必然会对土壤脲酶的活性产生重要影响。然而目前关于不同利用方式下土壤的理化性质,尤其是优势微生物菌群与土壤脲酶活性之间关系的研究还不明确。

沈阳市沈北新区是“国家可持续发展试验区”,近年来城市化发展迅速,大量农业用地转变为城建用地,是我国城市扩张的典型区域。因此,本文通过分析不同利用类型土壤脲酶活性变化特征及其与土壤理化性质、土壤细菌优势菌群之间的相关关系,探讨城市扩张区土壤脲酶活性的变化规律及其影响因素,为深入了解城市化对土壤环境质量的影响提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤分布及样品采集

采用均匀网格布点法在沈北新区全境共设置101 个采样点(图1),经纬度范围为123°16′44.45′′E— 123°42′44.27′′E,41°52′47.04′′N—42°10′4.33′′N。采样时间为2015年9月15日—2015年10月6日,期间以晴和多云天气为主。采样点按土壤利用类型分为旱田、城市绿地、天然林地和水田。其中,旱田采样点47 个,种植作物以玉米(34 个,已收割)为主、其他为萝卜、胡萝卜、西红柿、黄瓜等蔬菜(成熟期)及苜蓿;城市绿地采样点17 个,植物种类主要为杨树、山毛桃、火炬树、灌丛、草坪草及杂草;天然林地采样点15 个,植被包括油松、榆树、槭树、蒙古栎、杨树;水田采样点22 个,种植作物为水稻。采用梅花布点法,将土壤表层( 0—20 cm) 5 个位置的土壤样品除去动植物残体及石块,混合均匀,带 回实验室,一部分于-20 ℃冷冻保存用于土壤微生物高通量测序;另一部分室温风干过筛,于4 ℃条件下保存供土壤酶分析使用,一周内完成土壤酶活性测定。

图1 沈北新区土壤采样点分布示意图 Figure1 Location of sampling sites in Shenyang North New Area

1.2 土壤理化性质及脲酶活性测定

采用激光粒度仪测定土壤机械组成[24],分别测定土壤组分中0.01—2 μm 粒径(粘粒)、2—20 μm 粒径(粉粒)、20—200 μm 粒径(砂粒)的含量;环刀法测定土壤容重;烘干法测定土壤含水量;玻璃电极法测定土壤pH 值(土:水=1:2.5);重铬酸钾-外加热法测定土壤有机质含量;重铬酸钾-硫酸消化法测定总氮;高氯酸、硫酸-钼锑抗比色法测定总磷[25]。土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定[26],每个样品三次重复。

1.3 土壤细菌群落组成分析

采用高通量测序技术测定土壤微生物群落结构,选用Powersoil DNA Isolation Kit (MoBio,USA)试剂盒提取土壤基因组DNA,经0.8%琼脂糖凝胶电泳定性检查以保证条带单一,采用Nanodrop 2000 (Thermo,UAS)测定DNA 浓度及纯度,然后进行PCR 扩增。采用515F 和909R 引物扩增16S rRNA基因的V4 高变区片段。扩增产物经纯化、质控后,建立Illumina 测序文库,采用Illumina Miseq 平台进行Paired-end 250 bp 测序,测序工作委托中国科学院成都生物研究所完成。测序结果(.fastq)切除原始序列两端的测序接头后经FLASH软件拼接,然后用QIIME软件根据barcode将序列分配到相应样品,去除低质量序列和嵌合体之后,统计每个样品中的序列数,以最少的序列数为标准进行样品序列的重取样,以保证每个样品中含有的序列数相近,从而避免因序列数不同而导致的样品间差异。然后生成OTU (Operational Taxonomic Unit,采用序列相似度阈值97%)表,从每个OTU 中挑选出1 条代表序列,与细菌16S rRNA 基因序列数据库Greengenes 进行比对,获得各个OTU 的物种分类信息。

1.4 统计分析

利用Arc GIS 10.2 绘制采样点位图及酶活性分布图。采用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析,采用最小差数法(LSD)进行差异显著性分析,通过Pearson(双侧)相关分析判断土壤脲酶活性与土壤理化性质之间的相关性。利用Excel2010 软件对试验数据进行通径分析。采用Canoco for Windows 4.5 软件进行冗余分析,探究土壤细菌菌群与脲酶活性及土壤理化性质之间的关系。

2 结果与讨论

2.1 沈北新区土壤脲酶活性变化特征

图2 沈北新区不同利用类型土壤脲酶活性空间分布特征 Figure2 Spatial distribution characteristics of urease activity in different utilization types of land in Shenyang North New Area

如图2所示,沈北新区西北部的兴隆台锡伯族镇、石佛寺朝鲜族锡伯族乡、黄家锡伯族乡等以水田为主的地区土壤脲酶活性较低;南部离沈阳主城区相对较近的道义街道、虎石台街道、农高区管委会蒲河新城管委会等以城市绿地和天然林地为主的 地区土壤脲酶活性居中;而位于沈北新区西部的尹家乡、中部的财落街道、新城子街道及东部的清水台镇、马刚乡、蒲河街道等以旱田为主的地区土壤脲酶活性明显高于其他地区。总体上,沈北新区土壤脲酶活性呈现出由东向西、由中部向南北逐渐降低的趋势,这主要与其土地利用类型的区域分布有关。

2.2 不同利用类型土壤脲酶活性变化特征

由图3,旱田土壤平均脲酶活性(0.52 mg·g-1)显著高于其他三种类型土壤(P＜0.05);天然林地(0.34 mg·g-1)和城市绿地(0.32 mg·g-1)土壤脲酶平均活性次之,二者差异不明显;水田土壤脲酶平均活性(0.19 mg·g-1)最低。梁毅等研究也发现不同土地利用方式影响土壤脲酶的活性,具体表现为:旱地＞林地＞果园＞灌丛[27],这与本文旱田土壤脲酶活性高于天然林地和以灌丛、草地为主的城市绿地的研究结果基本一致。这说明土地利用方式对土壤脲酶活性具有较大的影响。在城市化过程中,大量农业用地转变为城建用地,其土壤脲酶活性也会发生相应地改变,直接影响土壤的供氮能力,从而改变土壤环境质量。就农业用地而言,旱田改为城市绿地后土壤脲酶活力将会下降,土壤供氮能力减弱;而水田变更为城建用地后其土壤脲酶活力将会提高,土壤供氮能力增强。

图3 沈北新区不同利用类型土壤脲酶活性变化特征 Figure3 Change characteristics of urease activity of different utilization types of land in Shenyang North New Area

2.3 土壤理化性质对土壤脲酶活性的影响

由表1,土壤脲酶活性与土壤含水量呈极显著负相关关系(P＜0.01),与总磷含量呈显著正相关关系(P＜0.05),而与土壤pH、容重、机械组成、有机质、总氮相关性不显著;说明土壤含水量和总磷是影响土壤脲酶活性的重要因素。土壤含水量与土壤机械组成呈极显著相关关系(P＜0.01),总磷与有机质和总氮呈极显著正相关(P＜0.01),说明土壤机械组成、有机质和总氮对土壤脲酶活性也具有一定的影响。

通径分析结果(表2)表明,土壤含水量和总磷对土壤脲酶活性影响的直接通径系数和综合通径系数均较大,说明其直接作用明显,并最终表现出强烈的综合作用。粘粒、砂粒、有机质和总氮对脲酶活性的直接通径系数较大,综合通径系数较小,说明其直接作用明显,但综合作用不明显。此外,通过分析还可发现,含水量、粘粒、砂粒三者及总磷、总氮、有机质三者通过彼此间对脲酶活性的间接通径系数均较大,说明它们彼此间的相互作用对脲酶活性也有较大的影响。该分析结果与表1所示的土壤理化性质与脲酶活性的相关关系相一致。

表1 土壤脲酶活性与不同土壤理化性质的相关关系 Table1 Correlation between soil urease activity and soil physical and chemical properties

表2 土壤理化性质对脲酶活性的通径系数 Table2 Path coefficient of soil physical and chemical properties to urease activity

土壤含水量是影响脲酶活性的重要因子,土壤水分可以直接影响酶活性的高低,也可以通过影响微生物的生长和土壤养分的有效性间接影响土壤酶活性[28]。万忠梅等[29]研究发现干湿交替和较干旱条件下土壤脲酶活性高于持续淹水状况下的活性,并且随含水量的增加酶活性降低;朱同彬等[28]研究表明,较高的土壤含水量会显著抑制土壤脲酶活性,这些研究结论与本文研究结果相一致。土壤有机质、全氮、全磷通过直接和间接作用成为影响脲酶活性的重要因素。Liu SY 等[30]研究指出土壤脲酶活性与土壤有机物质、全氮和全磷含量呈正相关。陶宝先等[31]经试验发现,脲酶与全磷、有机质在P＜0.01 水平下呈显著正相关,与全氮在P＜0.05 水平下呈显著正相关。土壤机械组成对土壤物理、化学和生物学特性具有重要的影响。土壤机械组成变化有助于改变土壤紧实度、通透性能及肥力状况,因此也会影响土壤微生物活动和土壤酶活性[32-35]。本研究结果表明土壤机械组成与土壤含水量显著相关,粘粒、粉粒含量增加,土壤持水能力增强,含水量提高;而砂粒含量增加,土壤结构疏松,孔隙增大,含水量下降,说明土壤机械组成可以通过土壤含水量间接影响脲酶酶活性。

2.4 土壤细菌群落组成对土壤脲酶活性的影响

土壤微生物是土壤的重要组成部分[36],大部分土壤酶是微生物新陈代谢过程中释放的活性物质,因此酶活性在一定程度上取决于微生物的组成和结构[37]。

通过对土壤样品中微生物16S rRNA 基因的V4高变区进行Illumina 测序,共检测到70 个菌门,其中出现相对丰度＞10%的优势菌门共有9 个,分别是泉古菌门(Crenarchaeota)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、蓝藻细菌(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)。

土壤中优势菌群丰度与理化性质及脲酶活性的冗余分析(RDA)结果如图4所示。从图中夹角大小及射线长度可以看出土壤细菌菌群、理化性质及脲酶活性间的关系。射线间夹角为锐角时表示呈正相关关系,夹角越小,相关系数越大;射线越长,所对应的变量影响越大。拟杆菌门(a4)、酸杆菌门(a2)、厚壁菌门(a7)、泉古菌门(a1)、放线菌门(a3)与土壤脲酶活性和砂粒含量呈正相关关系,而与土壤含水量呈负相关关系,表明这些菌群的丰度随土壤持水能力的增加而减小,与上文土壤脲酶活性随含水量升高而降低的变化趋势相吻合,提示这些菌群可能是土壤脲酶的重要来源。其中,放线菌门、泉古菌门、酸杆菌门射线较长,相关系数较大,说明其对土壤脲酶影响较强。

此外,冗余分析结果还表明酸杆菌门与土壤有机质和总氮呈正相关关系,与土壤pH、容重、总磷呈负相关关系;而泉古菌门与土壤pH、容重、总磷呈正相关关系,与土壤有机质和总氮呈负相关关系,说明这两种菌群丰度还受到土壤有机质、总氮、pH值、容重和总磷含量不同程度的影响。有研究表明,酸杆菌门细菌属于嗜酸菌,分布范围较广,在沈北新区土壤中丰度较高可能与其土壤呈弱酸性有关;泉古菌在非极端土壤环境中所占的比重非常高,这也预示其在土壤生物化学循环过程中的重要作用[38]。土壤微生物除受到土壤理化性质的影响外,还存在着复杂的相互作用,如共生和竞争关系等,因而不同利用类型土壤中微生物种群的变化规律及其对土壤酶活力的影响还需要进一步探究。

图4 土壤优势菌群丰度与理化性质及脲酶活性的RDA 排序图 Figure4 RDA sorting map of soil dominant bacterial abundance,soil physical and chemical properties and urease activity

3 结论

土地利用方式影响土壤脲酶活性,沈北新区不同利用类型土壤脲酶活性由高到低依次为:旱田＞天然林地＞城市绿地＞水田。

土壤含水量和总磷对土壤脲酶活性的影响除了直接效应外,还存在较强的通过其它因素的间接效应,是影响土壤脲酶活性的两个主要因素。

土壤脲酶活性与放线菌门、泉古菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、拟杆菌门菌群丰度呈正相关关系。其中,放线菌门、泉古菌门、酸杆菌门对土壤脲酶影响较大,可能是土壤脲酶的重要来源。