秦 燕，赵永康，周华安2，郭泓鋆2，杨 洪，李 兰

(1.成都市农林科学院，四川 成都 611130； 2.四川天宇种业有限责任公司，四川 成都 610101)

单倍体自然发生机率极低，一般不超过0.01%[1]，要获得大量的单倍体必须依靠人工诱导。1929年首次发现玉米单倍体[2]，1950年发现玉米单倍体诱导系Stock 6材料，使玉米单倍体育种技术由设想变为现实[3]。采用常规育种方法选育品种，周期长，效率低，财力物力人力花费很大。通过诱导获得单倍体，进行单倍体染色体加倍，只需2个世代就可以获得纯系(DH系)，缩短了自交系选育年限，加速了品种改良的进程[4]。单倍体育种技术在普通玉米育种中得到广泛应用[5-7]，也正逐渐应用于糯玉米育种中[8-11]，大大提高了糯玉米杂交组合的配制效率，缩短了优良糯玉米杂交种的选育年限。因此，本研究以2个糯玉米地方品种群体、2个人工合成糯玉米群体和2个糯玉米单交种为基础材料，利用单倍体诱导系进行杂交诱导、单倍体鉴定和染色体化学加倍，探讨单倍体技术在糯玉米育种中应用，加快糯玉米育种进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为四川农业大学引进的改良诱导系YD 1、YD 2、YD 3，3个诱导系均具有籽粒Navajo标记。6份诱导基础材料分别为从长江师范大学引进的糯玉米地方品种N 1、N 2及成都市农林科学院合成的糯玉米群体N 3、N 4及糯玉米杂交种N 5(苏玉糯202)、N 6(京科糯2000) (表1)。

1.2 试验方法

2016年春季在崇州羊马科技试验园区进行6个诱导基础材料的单倍体诱导杂交，每个基础材料种植300株，3个父本诱导系分期播种，使其父母本花期相遇。每个群体材料与诱导系各做20个杂交果穗，对得到的杂交果穗进行单穗单粒鉴定。

1.3 单倍体鉴定

在杂交果穗上逐粒鉴别: 紫色粒顶、无色胚芽尖的籽粒为拟单倍体，紫顶紫胚及无色粒顶、紫色胚芽尖的籽粒为非单倍体。在苗期依据植株生长势、株型以及紫色植株标记进一步鉴定，植株生长势强、植株高大、叶片宽大株型披散、茎干或叶片出现紫色的植株均为杂合植株，全部去除，保留生长发育慢、植株较矮、叶片上冲、叶色较浅的单倍体植株。

统计杂交籽粒数、拟单倍体籽粒数、出苗数、去除杂株数后，计算拟单倍体诱导率、标记鉴定准确率、校正单倍体诱导率。在计算标记鉴定准确率时，假设没出苗的均为单倍体籽粒，因为单倍体籽粒的生长势弱。

拟单倍体诱导率(%)=(拟单倍体籽粒数/杂交籽粒数)×100%；

标记鉴定准确率(%)=[(拟单倍体籽粒数-去除杂株数)/拟单倍体籽粒数]×100%；

表1 供试材料来源

供试材料系谱来源YD1(GY-1×ZY-1)×ZY-1BC3F1-4四川农业大学YD2(ZY-1×STOCK6)×ZY-1BC2F2-19四川农业大学YD3二倍体杂株×ZY-1F5-8四川农业大学N1重庆石柱白糯(地方品种)长江师范大学N2重庆秀山白糯(地方品种)长江师范大学N3白糯人工合成群体1成都市农林科学院N4黄糯人工合成群体2成都市农林科学院N5苏玉糯202白糯(N0201×N006)江苏南通志飞玉米研究所N6京科糯2000白糯(京糯6×BN2)北京农林科学院玉米研究中心

表2 糯玉米单倍体籽粒鉴定及田间鉴定结果

单倍体材料杂交籽粒数拟单倍体粒数拟单倍体率/%出苗株杂合株数出苗率/%标记鉴定准确率/%校正单倍诱导率/%N1×YD11356876.4681578.282.85.0N1×YD220141095.4861378.988.14.3N1×YD31546684.4561282.482.43.6N2×YD124091586.61262679.783.55.2N2×YD21398835.9561267.585.54.0N2×YD31876764.1651285.584.23.5N3×YD120051567.81341885.988.56.7N3×YD225121977.81483675.181.75.9N3×YD327131485.51122675.782.44.1N4×YD116431026.2742872.572.54.5N4×YD217031589.31023364.679.16.0N4×YD315471026.6742172.579.44.8N5×YD11679965.7771580.284.44.6N5×YD221631054.9722468.677.13.3N5×YD31835673.7481071.685.12.6N6×YD120791135.4772868.175.23.7N6×YD21834955.2741477.985.34.0N6×YD320131015.0682167.379.23.4

校正单倍体诱导率(%)=[(拟单倍体籽粒数-去除杂株数)/杂交籽粒数]×100%；

出苗率(%)=(出苗数/拟单倍体籽粒数)×100%。

1.4 染色体人工加倍

待拟单倍体植株长到6～7叶1心时，利用0.2 mL的0.06%秋水仙素+2%二甲基亚砜对单倍体植株进行注射加倍处理，待到散粉吐丝期进行单株挂牌和套袋自交。

统计化学加倍株数、散粉株数、结实株数，计算散粉株率、结实株率。

散粉株率(%)=(散粉株数/化学加倍株数)×100%；

结实株率(%)=(结实株数/化学加倍株数)×100%。

1.5 统计分析

数据统计采用Excel软件和DPS 7.05软件进行。

2 结果与分析

2.1 糯玉米单倍体籽粒鉴定及田间鉴定

以引进的诱导系YD 1、YD 2、YD 3为父本，糯玉米基础材料N 1～N 6做母本，籽粒鉴定结果见表2。从表2可知，糯玉米材料的杂交诱导籽粒数为1 356～2 713粒，平均数为1 906.9粒，获得的拟单倍体籽粒为67～197粒，平均数为112.3粒，拟单倍体率的变化幅度为3.7%～9.3%，变化幅度较大，平均拟单倍体率为5.9%。

将拟单倍体籽粒进行田间鉴定(表2)。从表2可知，糯玉米材料单倍体籽粒的出苗率为67.4%～85.9%，平均出苗率为75.0%，表明单倍体籽粒由于生长势较弱不能全部出苗，在实际应用中可适当加大基础材料与诱导系的杂交穗数。

从杂合株数及标记鉴定准确率来看，糯玉米材料的拟单倍体中均含有杂株，标记鉴定准确率为72.5%～85.5%，平均数为81.6%，表明由于不同基础材料遗传背景影响Navajo标记的表达，进而影响标记鉴定的准确度。糯玉米材料经过校正后的单倍体诱导率为2.6%～6.7%，平均诱导率为4.3%，变化幅度较大。

表4 各性状方差分析表

变异来源自由度出苗率/%标记鉴定准确率/%拟单倍体率/%校正单倍体诱导率/%散粉株率/%结实株率/%诱导系21.500.096.05∗6.17∗2.551.04基础材料51.461.584.37∗4.46∗4.62∗5.80∗误差100.00340.00150.00010.000050.00020.0001

注：“*”表示在0.05水平上显著。

2.2 糯玉米单倍体籽粒化学加倍分析

用秋水仙素对单倍体植株进行化学加倍处理，结果见表3。化学加倍后单倍体的散粉株率幅度为7.4%～15.5%，平均散粉株率为11.4%，化学加倍后单倍体的结实率幅度为2.6%～7.1%，平均结实率为5.1%，散粉株率和结实率的变化幅度均较大。

表3糯玉米单倍体化学加倍结果

单倍体材料化学加倍株数散粉株数结实株数散粉株率/%结实株率/%N1×YD1688411.85.9N1×YD28413515.56.0N1×YD3568314.35.4N2×YD11261269.54.8N2×YD2567412.57.1N2×YD36510415.46.2N3×YD113416711.95.2N3×YD214818812.25.4N3×YD3112958.04.5N4×YD1749512.26.8N4×YD210212611.85.9N4×YD3748410.85.4N5×YD1778310.43.9N5×YD272739.74.2N5×YD3486212.54.2N6×YD1778210.42.6N6×YD274739.54.1N6×YD368537.44.4

2.3 不同基础材料各性状差异显著性分析

将各基础材料与3个诱导系杂交所得单倍体的出苗率、标记鉴定准确率、拟单倍体率、校正单倍体诱导率、散粉株率、结实株率进行方差分析，结果见表4。由表4可知，出苗率、标记鉴定准确率在诱导系间和基础材料间的差异均不显著，而拟单倍体率、校正单倍体诱导率在诱导系间和基础材料间差异均达显著水平，基础材料间散粉株率、结实率差异也达显著水平。结果表明，单倍体诱导率受母本基础材料和父本诱导系影响均较大，而散粉株率、结实株率则主要受母本基础材料影响。

对差异达显著水平的性状按材料计算均数并做多重比较，结果见表5。从基础来料的拟单倍体率、校正单倍体诱导率来看，人工合成群体N 3、N 4的均值最高，高于地方品种N 1、N 2，显著高于单交种N 5、N 6。从基础材料的散粉株率和结实株率来看，地方品种N 1、N 2的均值较高，高于或等于人工合成群体N 3、N 4，显著高于单交种N 5、N 6。

从诱导系的拟单倍体率、校正单倍体诱导率来看，YD 2最高，显著高于YD 1和YD 3。诱导系的散粉株率和结实株率差异均不显著。

3 结论与讨论

单倍体诱导率受基础材料和诱导系影响均较大，而散粉株率、结实株率则主要受基础材料影响，与祁志云[6]等研究结果基本一致。因而在单倍体育种中，根据育种目标选择合适的基础材料和诱导系能大幅度提高单倍体育种效率。

基础材料的单倍体被诱导率从高到低依次是人工合成群体、地方品种、单交种，散粉株率和结实株率从高到低依次是地方品种、人工合成群体、高于单交种。分析其原因可能是因为本研究用的2个人工合成群体是选用10个糯玉米单交种经多年多代混粉合成，遗传基础最复杂，因而诱导率偏高，与李高科[12]等研究结果基本一致。而地方品种的散粉株率和结实株率最高则可能因为地方品种经过长期的自然选择，适应性较人工合成群体和单交种强，因而在育性恢复上偏高。

表5 糯玉米单倍体各性状差异显著性分析

基础材料 拟单倍体率/% 校正单倍体诱导率/% 散粉株率/% 结实株率/% 均值5%显著水平均值5%显著水平均值5%显著水平均值5%显著水平N15.4c4.3bc12.5a5.7aN25.5bc4.2bc12.6a6.0aN37.0ab5.6a10.6abc5.0abN47.4a5.1ab12.0ab6.0aN54.7c3.5c9.3bc4.1bcN65.2c3.7c7.8c3.7cYD15.5b4.3b9.7a4.9aYD27.2a5.3a11.7a5.4aYD35.0b3.6b11.0a5.0a

注：小写字母不同表示差异显著，相同小写表示差异不显著。

本研究所选用的3个诱导系中，YD 2的诱导率显著高于YD 1和YD 3，表明在糯玉米单倍体诱导育种中，可加大对诱导系YD 2的利用。