白羽祥，史普酉，杨成翠，贾 孟，王 戈，杨焕文，徐照丽

（1.云南农业大学烟草学院，云南 昆明 650201；2.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021）

烤烟是典型的忌连作作物，但在目前可耕地面积不断减少的背景下，烤烟连作现象依然普遍。连续种植一定年限后植烟土壤理化性质恶化［1-3］，微生物数量、功能和结构多样性失衡［4-5］，酶活性受抑［6-7］，最终导致诸如病虫害加重、生长发育进程受阻、产质量降低等连作障碍现象的发生［8-9］。土壤中酚酸类自毒物质积累被认为在连作障碍中扮演重要角色［10-11］，其积累特征已在水稻、大豆、花生、黄瓜、中药材以及林木等作物中予以初步明确［12-14］。目前，烤烟根系分泌物中已被鉴定出多种酚酸，并采用外源添加方法探讨其对烤烟自身的化感效应［15-18］，并依据其对烤烟种子萌发及幼苗生长、抗氧化酶及病原菌生长繁殖的影响推测酚酸类物质可能是导致烤烟连作障碍发生的重要因素［19-21］，但多数研究结论尚无直接证据［22-23］。

目前对连作土壤酚酸类物质的研究尚处在分离鉴定阶段［16-17］，酚酸类物质在土壤中的变化趋势和规律及其之间是否存在相互作用关系研究尚未涉及，这对研究酚酸类物质在连作障碍中的作用机制具有十分重要的意义。在实际问题中，当不能确定哪种曲线模型最接近样本数据时，可以运用曲线估计对各样本数据进行分析，以期明确最优的曲线模型［24］；由于各酚酸类物质之间具有复杂的关系，它们之间互相作用、互相影响［25］，双变量相关性分析并不能反应两个变量之间的真实关系，可以利用逐步回归模型对各变量之间的相互影响关系进行分析［26］。因此，本研究利用曲线估计和逐步回归模型对植烟土壤酚酸类物质在土壤中的变化趋势及规律和酚酸类物质之间的相互影响关系进行分析。本试验以连作4、6、8、14和16年的植烟土壤为研究对象，在其他条件一致的情况下，采用高效液相色谱（HPLC）法对各土样的酚酸类物质进行测定，研究连作年限对植烟土壤酚酸类物质种类和含量的影响；利用曲线估计模型研究植烟土壤酚酸类物质随连作年限增加的变化趋势及规律；在相关性分析的基础上，利用逐步回归模型研究不同连作年限条件下植烟土壤中各酚酸类物质之间的互相影响关系，旨在为研究酚酸类物质在连作障碍中的作用机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 连作植烟土壤样品采集

于2017年在保山市施甸县姚关镇陡坡村连片烤烟种植示范区（东经99.22°，北纬24.56°）采集土样，该区域土地由同一农户承包，土壤质地为砂壤土，种植烤烟品种为K326，前茬作物为大麦，每年烤烟施氮（N）量为120 kg·hm-2，施磷（P2O5）量为90 kg·hm-2，施钾（K2O）量为321 kg·hm-2，肥料由当地烟草公司提供，栽培管理措施统一按照当地优质烟叶生产技术进行。

采取分别种植4年（T4）、6年（T6）、8年（T8）、14年（T14）和16年（T16）烤烟的0～20 cm土样，每一种植年限土壤取3次重复，每个重复利用五点取样法采集5个土壤样品，除去表层后混匀。所取土样分两部分处理，一部分土样研磨过2 mm筛装入无菌封口袋后立即放入4℃冰箱中，用于酚酸类物质的测定；另一部分土壤风干，用于土壤理化性状的测定，各处理土样基本理化性状见表1。

表1 各处理土样基本理化性状

1.2 土壤样品处理及测定方法

土壤样品处理及测定参照李培栋等［27］的方法并依据本试验实际情况改进。每个处理称取100 g新鲜样品置于离心管中（3次重复），加入100 mL 1 mol·L-1NaOH放置24 h，然后震荡60 min，离心后将过滤液用12 mol·L-1的HCl酸化至pH值为2.5，120 min后离心除去胡敏酸，然后将上清液过0.22 μm的纤维膜，滤液用高效液相色谱（HPLC）仪测定，结果按照烘干土重换算。

土壤酚酸类化合物的测定采用HPLC法进行。仪器为Aglient1200高效液相色谱仪，色谱柱为SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），条件为流速1 mL·min-1，柱温为25oC，检测波长为280 nm。流动相A（甲醇）和流动相B（pH=2.5的乙酸水溶液）设置的具体梯度为：0 min，流动相A为30%，B为70%；15 min，流动相A为50%，B为50%；16 min，流动相A 为70%，B为30%；30 min，流动相A为0%，B为100%。标准样品分别为阔马酸、对羟基苯甲酸、间苯三酚、香草酸、香兰素、阿魏酸、邻苯二甲酸、苯甲酸、肉桂酸和水杨酸，进样量为10 μL。每个周期分析结束后，等待10 min，以便去除干扰成分的影响，保证分析结果的稳定性和重复性。

1.3 数据处理

试验数据采用Office 2013进行初步处理和作图；采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，并利用 Duncan's 新复极差法进行数据的多重比较和分析；利用曲线估计模型研究酚酸类物质的变化趋势和规律［24］；利用逐步回归模型对酚酸类物质间相互作用关系进行分析［26］。

2 结果与分析

2.1 不同连作年限植烟土壤酚酸类物质种类和含量分析

标准品进样共10种酚酸类物质，分别为间苯三酚、对羟基苯甲酸、阔马酸、香草酸、阿魏酸、香兰素、苯甲酸、邻苯二甲酸、肉桂酸和水杨酸（图1），在5个处理中均检出了8种酚酸类物质，分别为间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸（图2）。

随连作年限增加，植烟土壤中间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸和酚酸类物质总含量升高（图 3 a、b、c、d、e、f、i）；而苯甲酸和肉桂酸含量呈先升高后降低趋势（图3 g、h）。总体而言，植烟土壤酚酸类物质随连作年限增加呈现出积累特征。

图1 酚酸标准品色谱图

图2 样品色谱图

图3 连作对各酚酸类物质含量的影响

2.2 基于曲线估计的酚酸类物质积累特征分析

由2.1可知，连作植烟土壤检测出的8种酚酸物质中有6种呈现出积累趋势，分别为间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素和阿魏酸。以连作年限为自变量（t）、酚酸类物质含量为因变量（Y），利用曲线估计模型对各酚酸类物质含量变化规律进行拟合，从拟合结果来看，间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸和香兰素的6个拟合曲线决定系数大小均以增长曲线最高，而阿魏酸的拟合曲线决定系数大小以幂函数最高（表2）。因此，间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸和香兰素含量在连作条件下以增长曲线趋势积累；阿魏酸含量在连作条件下则以幂函数趋势积累（表 3）。

表2 具积累趋势酚酸的曲线估计

表3 具积累趋势酚酸的优选模型

2.3 各种酚酸类物质含量大小比较

5个处理中8种酚酸类物质的含量大小在前3位的分别为间苯三酚、对羟基苯甲酸和香兰素，且显著高于其他酚酸类物质（图4），说明连作对间苯三酚、对羟基苯甲酸和香兰素这3种酚酸类物质含量的影响较其他酚酸类物质大。

图4 各种酚酸类物质含量

2.4 基于逐步回归模型的酚酸类物质相互影响关系分析

相关性分析表明，不同酚酸类物质间相关性存在差异（表4）。除苯甲酸与其他酚酸类物质间低度相关外，其余酚酸类物质间均具中、高度正相关或负相关关系。逐步回归分析的标准化系数大小代表对应自变量影响力大小，标准化系数的正负则分别代表了该自变量对因变量起促进或抑制的影响作用［26］。因此，在相关性分析基础上，利用逐步回归模型对各酚酸类物质之间的相互影响关系进行分析，从结果来看，剔除无关变量后，筛选出了间苯三酚、阿魏酸、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸和香兰素的回归方程（表5），说明这6种酚酸含量受其他酚酸的影响，其余酚酸（苯甲酸和肉桂酸）含量不受其他酚酸影响或影响不显著。其中，间苯三酚和阿魏酸含量之间具显著的相互促进作用；阿魏酸对阔马酸含量具促进作用；香草酸对对羟基苯甲酸含量具促进作用；香兰素对香草酸含量具促进作用，而苯甲酸具抑制作用，且促进作用大于抑制作用；香草酸和苯甲酸对香兰素均具促进作用，且香草酸的影响力小于苯甲酸（表 5）。

表4 各酚酸类物质及其总含量相关性分析

表5 各酚酸类物质间的逐步回归方程

3 讨论

本研究在不同连作年限植烟土壤中检测出8种酚酸类物质，分别为间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，相对于前人在花生［28］、苹果［29］、草莓［30］、和杨树［31］连作土壤中检测出的酚酸种类而言多出3到4种，说明不同作物的连作土中酚酸类物质种类有一定差异。土壤酚酸类物质积累是引起作物连作障碍的重要原因之一［10-11］，孙海兵等［29］对苹果园的连作土壤研究发现，非连作土壤中酚酸类物质含量显著少于连作土；李贺勤等［30］对草莓连作土壤研究发现对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸和肉桂酸含量随连作年限增加显著升高。本试验得出相似结论，5个处理中的间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、香兰素的含量和酚酸类物质总含量均随连作年限增加而升高；对于苯甲酸和肉桂酸而言，其含量变化随连作年限增加呈先升高后降低趋势，但谭秀梅等［31］在杨树连作土中研究发现这两种物质表现为增加趋势，这可能是种植作物和连作年限的长短不同造成的，具体原因还有待进一步探究。尽管土壤微生物在一定程度上会降解酚酸类物质［32-34］，但连作条件下酚酸类物质仍呈积累趋势［27，29-30］，而前人并未针对不同种类酚酸的积累趋势和规律进行研究，在通过外源添加的方式研究酚酸类物质的化感作用时，往往不是基于田间实测值设定酚酸浓度［35］，而探明不同种类酚酸随连作年限增加的变化趋势和规律对研究酚酸类物质在连作障碍中的作用机制具有十分重要的意义。本研究利用曲线估计模型，发现间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸和香兰素含量在连作条件下以增长曲线趋势积累，阿魏酸含量在连作条件下以幂函数趋势积累。因此，酚酸类物质在连作条件下积累模型的建立对外源添加酚酸类物质的试验具有一定的指导意义，可基于田间酚酸类物质的绝对含量并借助模型设定外源添加酚酸类物质的含量。

通过对5个处理中8种酚酸类物质的含量进行比较分析，发现间苯三酚、对羟基苯甲酸和香兰素的含量明显高于其他物质，但考虑到酚酸类物质之间的协同作用、拮抗作用以及各种酚酸类物质之间的综合作用，单靠某一种物质含量的高低来说明其产生作用的大小有失偏颇，因此，对酚酸类物质在连作障碍中的作用机制还有待进一步研究和探索。Blum［25］提出，化感物质会共同作用于植物而产生复合效应，即协同、拮抗和累加作用。王璞等［36］通过外源添加酚酸的方式对棉花种子萌发的研究表明，对羟基苯甲酸、阿魏酸和香草酸之间具有显著的协同作用，但沈荔花［37］对加拿大一枝黄花（Solidagocanadensis L.）的研究表明酚酸各组分之间存在拮抗作用。由此可见，前人是通过研究酚酸类物质对作物产生的效应来直接研究其拮抗或协同作用的。在前人研究的基础上，本研究通过逐步回归模型研究某些酚酸类物质对某种酚酸含量的影响来间接表明两者之间是否存在协同或拮抗作用。逐步回归分析表明，部分酚酸类物质含量之间存在促进或抑制作用，具体表现为：间苯三酚和阿魏酸含量之间存在互相促进的关系；阿魏酸对阔马酸含量有促进作用；香草酸对对羟基苯甲酸含量有促进作用；香兰素对香草酸含量有促进作用，而苯甲酸对其含量则存在抑制作用，且香兰素的促进作用大于苯甲酸的抑制作用；香草酸和苯甲酸对香兰素含量有促进作用，且香草酸的促进作用小于苯甲酸。以上结果说明部分酚酸类物质含量间存在显著的促进或抑制作用，为进一步研究酚酸类物质间的相互作用提供了一定的理论依据，但因研究方法和技术的限制，目前对酚酸类物质间的相互作用关系研究尚属摸索阶段，还需进一步研究和探讨。

4 结论

连作植烟土壤中共检出8种酚酸类物质，分别为间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，且不同酚酸类物质含量之间存在差异。

连作条件下，植烟土壤酚酸类物质呈积累特征；曲线估计分析表明，间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香兰素和香草酸含量以增长曲线趋势积累，阿魏酸含量以幂函数趋势积累。

逐步回归分析表明，部分酚酸类物质之间相互影响，且存在不同程度的促进或抑制作用。