周 琪,张海萍,闫金银

(唐山市人民医院 乳腺外科，河北 唐山063000)

乳腺癌已成为世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,也是引起女性死亡的重要病因。乳腺癌的总体发病率及年龄特异性发病率均呈上升趋势，解决这一医疗难题显得日益迫切和严峻。

近年来，从传统中药和天然植物中提取防治肿瘤的有效成分已成为治疗肿瘤的希望和新途径。蒜素是大蒜中主要生物活性成分的总称，为多种烯丙基有机硫化合物复合体，近些年研究证实，其具有抗菌消炎，提高免疫力，抗肿瘤等多重作用。但作为有机硫化物的混合物，蒜素由于其稳定性差，易挥发，不稳定，易分解，并具有独特的臭味和刺激性，很难在临床上开展应用。S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)是水溶性有机硫化物，是蒜素的主要生物活性成分，为白色无味，拥有较高的生物利用度和稳定性，其制备可从蒜素中提取，也可通过化学方法合成。相关研究证实，SAMC可以直接抑制体外培养的结肠癌、肺癌、乳腺和胃癌细胞的增殖。但在动物模型中，对乳腺癌肿瘤的直接抑制及其作用机制却较少见研究。本实验重点观察SAMC对乳腺癌细胞NF-κB及MAPK细胞信号传导通路的影响来确定SAMC的抗乳腺癌机制。为今后应用SAMC治疗乳腺癌提供理论基础与实验依据，进一步为乳腺癌的治疗提供新的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 材料和主要仪器

人乳腺癌细胞系MCF-7，购自于深圳百恩维生物科技有限公司。SAMC(北京世纪奥科生物技术有限公司)。Balb/c nude裸鼠，雌性。购于北京维通利华实验动物技术有限公司。4周龄，体重170-200 g，无特殊病原体环境(spcific-pathogen free，SPF)饲养。SP免疫组化超敏检测试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。p-p38 抗体，IKK-β抗体(美国Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 方法

1.2.1乳腺癌裸鼠模型的建立 常规方法复苏MCF-7细胞株，加入DMEM培养液。放入37℃含5%二氧化碳培养箱中培养传代。收集处于对数生长期的细胞,经磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后制成浓度为1×106/ml的细胞悬液，接种于裸鼠皮下(0.2 ml/只)。1周后选造模成功的裸鼠30只实验待用。

1.2.2实验分组及标本采集 将种瘤成功的裸鼠称重后，将30只裸鼠应用随机数字表分为3组，每组10只，即对照组(腹腔注射生理盐水 0.2 ml)、SAMC低浓度组(腹腔注射SAMC150 mg/kg)、SAMC高浓度组(腹腔注射SAMC 250 mg/kg)每周给药5次，共治疗3周。治疗期间,每天观察裸鼠状况，每4天使用精度为0.1 mm的游标卡尺分别测量对照组、SAMC低浓度组、SAMC高浓度组裸鼠肿瘤的最大径和最小径，于首次给药后第21天脱颈处死全部裸鼠。

切取各组裸鼠的肿瘤组织,并称量瘤重，计算各鼠抑瘤率，IR=(1-瘤重/对照组瘤重平均值)×100%；同时测量瘤体的最大径和最小径，并根据公式：体积=最小径×最小径×最大径×0.5，计算出瘤体积。切取适量瘤组织置于-80℃冰箱中冷藏待用。其余瘤组织以10%多聚甲醛固定72 h后,石蜡包埋,以备后用。

1.3 免疫组化法检测p-p38MAPK 及 IKK-β表达

组织切片标本常规脱蜡、水化，3% H2O2孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min×3 次，分别滴加一抗p-p38 抗体，IKK-β抗体，4 ℃过夜。PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗 羊抗兔IgG抗体，室温孵育60 min。PBS冲洗5min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育20 min。DAB显色，自来水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察。400倍光镜下，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对免疫组化结果进行定量分析，分别测量各组的平均光密度值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 SAMC对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤体积的影响

为了明确各组肿瘤的生长变化情况，本实验分别于给药第1，5，9，13，17，21天测量对照组、低浓度组、高浓度组裸鼠荷瘤的长径和短径，并计算每组裸鼠肿瘤体积，见表1。由其体积变化可知，SAMC明显抑制了肿瘤的生长，这种差别随着治疗的继续而变得越加明显。

2.2 SAMC对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤生长的影响

称取瘤重后，SAMC两组与对照组之间均有显著差异(P<0.001)，高、低浓度SAMC组间有显著差异(P<0.001)。低浓度组和高浓度组抑瘤率分别为36.8±11.41%和51.91±5.13%，具有统计学差异(P=0.002)，见表2。

2.3 免疫组化法检测相关蛋白结果

免疫组化结果显示，p-p38MAPK蛋白阳性表达位于癌细胞的胞核，部分位于胞质。而IKK-β蛋白阳性表达主要位于癌细胞的胞质中。见图1。

表1 治疗中各组肿瘤体积的变化

注：经重复测量方差分析，不同时间点体积变化差别有统计学意义(F组内=843.474，P<0.001)；不同组间研究对象体积差别有统计学意义(F组间=49.071，P<0.001)，时间和组别对体积变化的交互作用有统计学意义(F交互=60.542，P<0.001)

表2 治疗结束后各组肿瘤生长的情况

使用Image-Pro Plus软件检测平均光密度值。p-p38MAPK对照组为0.10±0.01；低浓度组为0.19±0.02；高浓度组为0.36±0.04。IKK-β对照组为0.47±0.05；低浓度组为0.21±0.02；高浓度组为0.13±0.01。

图1 各组裸鼠乳腺癌免疫组化情况

与对照组相比，低浓度组和高浓度组的p-p38MAPK表达明显增高，差异具有显著性(P<0.001)。同时该蛋白在高浓度组中的表达要强于低浓度组，差异具有显著性(P<0.001)，与对照组相比，低浓度组和高浓度组的IKK-β表达明显降低，差异具有显著性(P<0.001)。同时该蛋白在低浓度组中的表达要强于高浓度组，差异具有显著性(P<0.001)。见表3。

3 讨论

蒜素可以通过调节致癌物的代谢、阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、抗氧化和提高机体免疫力等途径抑制动物体内的肿瘤生长，同时，联合应用还能提高化疗药物的治疗作用。但由于其化学稳定性差，容易被分解，进入人体后易被代谢，清除，导致其在某些体内试验及临床试验，不能提供完美的抗癌证据[1]。SAMC，提纯自蒜素，但拥有较高的生物利用度和稳定性，对于其是否具有应用于实体瘤临床治疗的潜能，人们已经相继开展了一些体外的研究工作。本研究中，我们发现SAMC可以通过影响p38MAPK及IKK/NF-κB细胞信号传导通路,使移植至裸鼠的乳腺癌体积缩小，起到抗肿瘤的作用。

表3 p-p38MAPK、IKK-β在各组移植瘤中的表达量

注：与对照组比较，aP<0.001;与低浓度组比较，bP<0.001

本实验证实，SAMC对裸鼠移植乳腺癌肿瘤的生长有抑制作用。对照组瘤体积为：(507.47±75.88)mm3；SAMC低浓度组瘤体积为：(369.8±30.36)mm3；SAMC高浓度组瘤体积为(241.95±35.84)mm3。对照组瘤重为(0.46±0.04)g；SAMC低浓度组瘤重为(0.31±0.02)g；SAMC高浓度组瘤重为(0.22±0.03)g。SAMC低浓度组抑瘤率为(36.8±11.41)%，SAMC高浓度组率为(51.91±5.13)%。无论是瘤体积、瘤重还是抑瘤率，SAMC两组与对照组之间均有显著差异。说明SAMC的确抑制了乳腺癌肿瘤的生长。

P38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的重要成员，多种细胞外因子可使其磷酸化后而被激活。活化后的p38MAPK(p-p38MAPK)可通过多种方式影响细胞的增殖，分化，迁移及凋亡。SAMC可以通过JNK和P38MAPK途径阻止人肠癌细胞SW620的增殖并诱导其凋亡[2]。有报道大蒜提取物DATS抑制裸鼠移植乳腺癌肿瘤的生长，并通过体外细胞学试验发现DATS处理后的SGC-7901细胞中p-p38MAPK蛋白量增加[3]。本研究直接利用裸鼠移植瘤模型，在实体瘤中发现，低浓度组及高浓度组中p-p38MAPK 蛋白量明显高于对照组，这说明SAMC可激活p38MAPK，进而通过MAPK信号转导途径产生抑瘤作用。

对于蒜素通过NF-κB信号转导途径影响肿瘤细胞的研究并不少见[4,5]。有报道利用亚硝基二乙胺(NDEA)建立了大鼠的肝癌模型，并使用蒜素油治疗[6]。结果显示，NDEA可降低IκB的表达水平和促进NF-κB p65磷酸化，诱导肝癌的产生，但加用蒜素油之后，可明显逆转NDEA的这种作用。作为调控细胞增殖、分化和凋亡的重要信号通路，NF-κB途径的调控机制研究一直是该领域的热点内容[7]。但研究方向多在NF-κB的核转位，及IKK复合体酶活性方面，本研究发现SAMC可以直接调节IKK-β的表达水平，还属鲜见。而对于SAMC对NF-κB核转位的影响我们也将在后继试验中展开。

综上所述，本实验成功的建立了乳腺癌裸鼠模型，使用不同浓度的SAMC抑制了乳腺癌肿瘤的生长。通过免疫组化法，检测到肿瘤细胞p-p38MAPK蛋白量增加，同时IKK-β蛋白量降低，说明SAMC可能通过MAPK以及NF-κB两条途径对乳腺癌细胞产生抑制作用，为乳腺癌的治疗提供了新的途径。