王金涛,张 成,杨 林,安东均,王 羊,赵宝国,韩 立

(咸阳市中心医院 肝胆外科,陕西 咸阳712000)

肝外胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是来源于肝外胆管上皮细胞的一种不常见但非罕见的恶性肿瘤，外科完全切除肿瘤(包括达到组织学切缘阴性)是肝外胆管癌患者获得长期生存的唯一方法，但由于其解剖部位的特殊性及生物学特征，手术切除率较低，预后差[1]。因此，对胆管癌患者而言，新的分子病理探索显得尤为重要。

CCA的分子发病机制涉及伴有或不伴有肝吸虫产生多种因子的长期炎症反应。最近的研究也表明炎症标志物，即中性粒细胞/淋巴细胞比值，是CCA预后不良的标记[2,3]。T淋巴细胞在胆道癌的炎症中是常见的细胞类型，患者的T和B淋巴细胞与更长的生存期相关[4]。程序性死亡配体-1(Programmed death ligand-1，PD-L1)是B7家族成员之一，由290个氨基酸组成。膜型PD-L1属I型跨膜蛋白，由胞内区、跨膜区及胞外区组成。PD-L1的胞外区与活化T细胞表面的程序性死亡受体-1(Programmed death receptor-1，PD-1)结合，通过PD-L1/PD-l途径诱导T细胞凋亡并抑制其增殖，参与抑制抗肿瘤细胞免疫。越来越多的证据表明，阻断PD-1/PD-L1通路可以使多种癌症产生持久的反应，延长其生存周期，包括黑色素瘤，肺、肾肿瘤[5-7]。因此，从这种新颖的免疫疗法角度出发，阻断PD-1/PD-L1通路是有望成为治疗CCA的方法。

PD-L1的表达在多种肿瘤组织中都有报道并与预后差相关[8,9]。然而，在CCA领域中尚未见PD-L1相关文献报道。本研究旨在探讨PD-L1的表达及其与CCA患者的临床病理特征及总生存期的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取我院2015年1月至2017年5月间收治的46名接受手术切除肝外胆管癌患者的临床资料和病理标本，所有患者术后病理诊断明确，术前没有进行放化疗等抗癌治疗，并具有完整的随访资料。该研究获得医院伦理委员会的批准，并在病人取样前获得知情同意。

1.2 免疫组化

取切除的病理标本用石蜡切片机切片至7 μm厚度，42℃水浴展片，捞片，55℃烘箱过夜。之后依次经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水、柠檬酸抗原修复液修复，按照1∶100滴加一抗(兔抗人PD-L1抗体,Abcam公司)。24 h后，PBS洗涤3次后，滴加生物素标记的二抗(Sigma公司)，然后再滴加亲和素标记的过氧化物酶，PBS洗涤3次后，显色5 min，待显色完全后蒸馏水终止显色，苏木素复染1 min，洗涤后风干，中性树胶封片。

1.3 PD-L1表达的评分

在肿瘤细胞膜表达的量化由两个人独立统计结果。当肿瘤细胞膜染色>1%时，PD-L1即被定义为阳性。

1.4 预处理系统炎症，营养和肿瘤标志物的分析

预处理的血液标本进行常规全血计数和白蛋白分析。白细胞、血小板、中性粒细胞和淋巴细胞计数用全自动血液分析仪分析。血清白蛋白、胆管癌抗原(CEA)和癌症抗原19-9(CA19-9)是用自动分析仪测量。全身炎症反应由中性粒细胞-淋巴细胞比值(NLR)来衡量，NLR的定义是中性粒细胞绝对数除以绝对淋巴细胞计数。没有病人在血液采样时感染或脓毒症的临床记录。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0 进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。使用频率和百分比描述分类变量。组间比较采用独立样本t检验，采用Fisher精确检验分析PD-L1和临床病理特征之间关联，采用Cox回归模型进行生存分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 入组患者的临床资料

这项研究共包括46名病人，年龄中位数为57.5岁，大部分患者为男性(72%)。亚型为肝内CCA(n=33)和肝外CCA(n=13)。此外，中度至高度分化组有39例患者，低分化肿瘤组有7例患者。TNM分期Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ分别诊断出4,10,12和20位患者。发现7例患者(15.2%)诊断出有远处转移，18例患者(39.1%)有淋巴结受累。所有患者在手术后均接受氟尿嘧啶为基础的化疗(表1)。

表1 CCA患者的基本特征(n=46)

2.2 PD-L1在肿瘤细胞中的表达及临床病理特征

在胆管癌组织中PD-L1阳性表达的患者有32例(69.6%)(图1)。在多数低水平的阳性表达的患者中，PD-L1的表达从1.2%到34.7%，中位数为1.75% 。46位患者的PD-L1表达和临床变量之间的关联汇总见表2。有一个显著高的NLR(>3)和PD-L1表达(OR=5.36，P=0.018)及TNM Ⅳ阶段的疾病(OR=3.98，P=0.046)有显著的相关性。PD-L1 的阳性表达和患者年龄、性别、病理淋巴结状态、肿瘤分级、血清白蛋白没有显著的相关性。此外，PD-L1的阳性表达和肿瘤标志物CEA与CA 19-9也没有相关性(表2)。

A.PD-L1在胆管癌患者样本的表达。棕黄色代表PD-L1的表达强度;B.PD-L1在正常样本的表达(放大倍数：400X)

表2 CCA患者的基本特征(n=46)

2.3 PD-L1阳性率及整体生存率

最终，44例患者(95.6%)去世。总生存期中位数为7.77个月(95% CI 5.3-10.20)。相比PD-L1阳性患者生存中位数为7.23个月(95% CI 4.27-10.19)，PD-L1阴性的患者生存中位数为7.97个月(95% CI 1.43-14.51)。PD-L1阳性肿瘤患者没有明显死亡风险增加的趋势(HR=1.39，95% CI 0.72-2.68，P=0.32)(图2)。

图2 PD-L1表达与胆管癌患者术后生存时间的关系

3 讨论

胆管癌占消化系统恶性肿瘤总数的 2%-3% ，近年来，其发病率与病死率逐年攀升。因其特殊的解剖学部位以及侵袭性生长的特点，根治性切除率仅为 15%-20% 。该病早期缺乏特异性临床表现及有效的筛查手段，就诊时多为中晚期，预后极差，平均生存期为 6-12 个月,5 年生存率为 0-16.5%[10]。

本实验中的研究对象 PD-L1 在淋巴与非淋巴组织中均可调节外周组织中 T 细胞和 B 细胞的免疫应答及炎症反应。PD -1 可通过与 PD-L1 结合传递抑制信号，负性调控机体免疫应答过程，抑制 T 细胞的增殖以及细胞因子的分泌，介导肿瘤免疫耐受，促进肿瘤细胞生长[11]。Wang 等[12]通过建立 COX 比例风险回归模型分析发现 PD-L1 可作为胰腺癌患者预后评价的独立指标。PD- L1 在胃癌组织、 非小细胞肺癌组织、 结直肠癌组织中高表达，且与淋巴结转移相关，其机制与 PD-L1 受体在转移淋巴结中特异高表达有关。David R 等[13]证实乳腺癌组织中 PD-L1 表达明显升高，且与分化程度呈负相关，与TNM 分期呈正相关。近年来，在许多癌症中，PD-L1已经被发现表达和作为治疗免疫检查点抑制剂的靶点，但对 PD-L1 对胆管癌作用的研究仅见于个别文献[14,15]，具体机制仍不清楚。本研究发现PD-L1 在胆管癌组织及癌旁组织中呈阳性或弱阳性表达，而在正常组织中呈阴性表达。70%胆管癌患者的PD-L1表达上调，PD-L1的表达增加NLR的基线，且PD-L1与系统性炎症存在显著相关。与其他文献相同的是，我们发现PD-L1的表达与更高阶段的疾病有相关性，而与患者的年龄、性别、淋巴发现结节状态或肿瘤分级没有相关性。有趣的是，在这项研究中，系统性炎症的标记物NLR的增加和PD-L1的高表达呈显著正相关。NLR在许多癌症中都被研究，包括胆管癌，是一个预后不良的因素[2,3]。在最近的meta分析表明，术前高NLR与胆管癌患者短的生存时间相关。据我们所了解，本实验是首次研究胆管癌中NLR和PD-L1之间关联的报道。本研究的缺陷是样本数量小并且缺乏一些临床资料。

综上所述，在70%的胆管癌中观察到PD-L1的表达，且PD-L1阳性表达与NLR的增加和较高的肿瘤分期呈相关性。因此，PD-1/PD-L1通路是一个潜在的免疫治疗肝胆癌的新靶点。