吴丹，王静，黄碧云，王艳，刘龙*

(1.广州医科大学药学院， 广东 广州 511436;2.天津佰肽特医药科技有限公司， 天津 300000;3.信阳师范学院生命科学学院，河南 信阳 464000)

小花鬼针草(BidensparvifloraWilld. ) 为菊科(Compositae)鬼针草属 (BidensL.)植物，全草入药，具有清热、解毒、抗氧化、抗疟疾等功效[1-2]。目前，文献报道从鬼针草属植物中分离的化学成分主要有黄酮类、酚酸类、多炔类、挥发油等[3-4]，其中黄酮类具有有活血化淤 、降压通脉的功效，对动脉粥样硬化、血管栓塞疾病有预防和治疗作用[5-6]；酚酸类成分具有止血、抗菌等功效[7]。

目前文献报道的对小花鬼针草中黄酮类成分的含量检测多采用紫外分光光度法[8]、高效液相色谱法[7, 9-10]、高效毛细管电泳法[11]等方法，这些方法虽能够实现对成分的含量测定，但存在有一定的缺陷，比如分析时间较长、方法灵敏度较低等。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)是近几年来新兴的液质联用技术，与常规液相色谱相比分析速度更快、分离度及灵敏度更高，已广泛应用于血药浓度检测，以及中草药、中成药、化学药物有效成分与杂质的检测[12-15]。本文参照相关文献中小花鬼针草黄酮类成分的检测方法，建立了UPLC-MS/MS同时检测小花鬼针草中6种单体成分原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和山奈酚的方法，该方法分析时间短、灵敏度高、专属性强，能够为小花鬼针草的质量控制提供有效的参考依据。

1 实验设备与材料

超高效液相色谱-串联质谱联用系统(美国Agilent 1290/6460，配有ESI源，Mass Hunter 工作站)；移液器(德国Eppendorf Research Plus系列)；电子分析天平(瑞士Metter Toledo ME155DU)；超纯水器(美国Thermo Fisher GenPure Pro Standard)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司KQ-118)。

对照品原儿茶酸(批号110809-201205)、芦丁(批号100080-201610)、槲皮苷(批号111538-200302)、槲皮素(批号100081-200907)、山奈酚(批号110861-201611)、芍药苷(批号110736-201640，作为内标物)均购自中国食品药品检定研究院；金丝桃苷(批号G1411047)购自阿拉丁试剂有限公司，质量分数均大于等于98%。药材小花鬼针草于2017年采自广州新造镇，由本校生药学教研室鉴定为小花鬼针草的干燥全草。乙腈、甲醇均为色谱纯；甲酸为质谱级；水为超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent SB C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～4 min，30%乙腈；4～5 min，30～80%乙腈；5～10 min，80%乙腈。流速为0.4 mL/min；进样量1 μL，柱温为35 ℃。

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：多反应检测(MRM)模式，负离子检测；其他质谱条件：源喷射电压4000 V，离子源温度300 ℃，干燥气流量11.0 L/min，雾化器压力103.4 kPa。其他质谱参数见表1。

表1 小花鬼针草中6种单体成分及内标物的主要质谱参数

2.3 混合对照品溶液的制备

2.3.1 混合对照品储备液的配制

分别精密称取原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素和山奈酚对照品至容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成对照品储备液。精密移取各对照品储备液至10 mL量瓶中，用甲醇定容得混合对照品储备液，各标准品的质量浓度分别为原儿茶酸25.13 μg/mL、芦丁29.89 μg/mL、金丝桃苷27.50 μg/mL、槲皮苷13.06 μg/mL、槲皮素12.75 μg/mL和山奈酚24.25 μg/mL。

2.3.2 内标储备液的配制

精密称取芍药苷对照品至容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为210 μg/mL的内标储备液。

2.3.3 混合对照品溶液的配制

分别精密量取内标储备液10 μL，混合对照品储备液适量，移至1.5 mL离心管中，用甲醇稀释，配制成不同质量浓度的混合对照品溶液。

2.4 样品溶液的制备

精密称取小花鬼针草药材粉末(过 3 号筛)1 g，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇溶液10 mL，密塞，称重。室温下超声提取60 min。提取后放至室温，称定质量，用溶剂补足所失重量。取上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，然后取滤液500 μL移至1.5 mL离心管中，加甲醇490 μL，内标储备液10 μL，混合均匀即得样品溶液。

3 实验结果

3.1 专属性考察

分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液(不含小花鬼针草药材)进样分析，进样量为1 μL，按2.1项下色谱条件及2.2项下质谱条件分析，得原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品总离子流图，见图1。由图可知方法专属性良好，各检测成分间无相互干扰，且空白溶液(即阴性样品溶液)对各检测成分无影响。

1 原儿茶酸；2 芦丁；3 金丝桃苷；4 槲皮苷；5 槲皮素；6 山奈酚；7 芍药苷图1 混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液的提取离子流色谱图Fig.1 EIC of mixed reference solution, test solution and negative sample solution

3.2 线性关系及定量限、检测限考察

在2.1项色谱条件和2.2项质谱条件下进样检测不同质量浓度的混合对照品溶液，以各待测成分质量浓度为横坐标(X)，待测物峰面积与内标物(芍药苷)峰面积之比为纵坐标(Y)，绘制线性标准曲线，得到各待测成分的线性回归方程。选取信噪比(S/N)大于10时各待测物质量浓度作为定量限(LOQ)，S/N大于3时各待测物质量浓度作为检测限(LOD)，结果见表2。

表2 6种单体成分的线性范围、相关系数、定量限和检测限

3.3 精密度实验

取2.3项下的混合对照品溶液，连续重复进样6次，计算各成分与内标物的峰面积比值，并计算相对标准偏差。原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚峰面积的相对标准偏差分别为2.04%、1.95%、1.50%、1.97%、2.04%、2.15%。

3.4 稳定性实验

取样品溶液，配制后在室温下放置，分别在0、4、8、12、18 、24 h时进样检测，计算各待测物与内标物的峰面积比值，并计算相对标准偏差。其相对标准偏差分别为原儿茶酸1.91%、芦丁2.03%、金丝桃苷1.46%、槲皮苷 2.04%、、槲皮素2.13%、山奈酚2.51%。结果表明，样品溶液在室温条件下，24 h内稳定性良好。

3.5 重复性实验

取小花鬼针草粉末1 g，精密称定，照2.4项下方法制备样品溶液，平行制备6份，进样检测，并计算实测浓度。6份平行样品各待测物实测浓度相对标准偏差分别为原儿茶酸1.35%、芦丁1.65%、金丝桃苷 1.46%、槲皮素 4.49%、槲皮苷4.44%、山奈酚4.97%。

3.6 加样回收率实验

取小花鬼针草粉末1 g，精密称定，平行称6份。精密称取原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚对照品适量，用甲醇溶解并定容，配制成各成分浓度分别为原儿茶酸115.6 μg/mL、芦丁130.7 μg/mL、金丝桃苷80.2 μg/mL、槲皮苷45.2 μg/mL、槲皮素34.8 μg/mL、山奈酚10.2 μg/mL的对照品混合溶液。每份样品中1.00 mL上述对照品混合溶液，挥干溶剂，按2.4项下方法制备样品溶液，按2.1与2.2项下的条件进样检测，计算各成分的含量及回收率。结果见表3。

表3 6种待测成分的回收率实验

续表3

3.7 样品测定

对样品溶液进行含量测定，得到小花鬼针草中原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚质量分数依次为105.52 μg/g(RSD=1.35%，n=6)、120.05 μg/g(RSD=1.65%，n=6)、70.02 μg/g(RSD=1.46%，n=6)、44.88 μg/g(RSD=4.49%，n=6)、29.94 μg/g(RSD=4.44%，n=6)、9.33 μg/g(RSD=4.97%，n=6)。

3.8 讨论

3.8.1 色谱条件优化

在进行6种待测成分检测时，为避免出现峰拖尾的现象，同时为了提高电离效率，在水相中加入少量甲酸，即选择0.1%甲酸水作为水相。6种待测成分中芦丁和金丝桃苷保留时间接近，色谱完全分离较困难。本文尝试采用不同的色谱柱(Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm；Agilent Eclipse C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm)，不同的流动相组合(乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水)及不同的流动相比例来实现两者的完全色谱分离。结果表明，采用Agilent Eclipse C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm色谱柱及甲醇体系，两者分离效果差，所以最终选择Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，灵敏度高，分析时间短，各待测物分离效果好，方法专属性强。

3.8.2 质谱条件的优化

本文尝试采用SIM模式对待测成分进行定量检测，该模式下方法专属性差，样品溶液中干扰较多。6种待测成分及内标物在MS2Scan及Product Ion两种扫描模式下，均可获取母离子及子离子信息，且Negative模式下灵敏度明显优于Positive模式，所以本文采用负离子MRM模式检测6种待测成分，同时采用optimizer工作站对6种待测成分及内标物的Fragmentor碎裂电压、CE碰撞能进行优化，以确保各待测成分的高响应值和高灵敏度。

3.8.3 内标物的选择

进行6种待测成分含量检测时，为避免仪器进样误差等，本文采取内标法。内标物的选择至关重要，其结构应与待测成分类似，保留时间相近，且不得存在于小花鬼针草提取物中。本文通过对甘草酸铵、芍药苷、异鼠李素等化合物进行分析，综合其保留时间，最终选择芍药苷作为内标物。

4 结论

本研究建立的UPLC-MS/MS分析方法，可快速分离检测小花鬼针草中原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚的含量。该方法简单快捷、灵敏度高，可为小花鬼针草药材的质量控制提供科学依据。