谢昌营，吴成成，肖慧荣

(江西中医药大学附属医院，南昌 330006)

肛瘘是一种反复发作的肛肠疾病，主要有流脓、疼痛、瘙痒等局部症状，急性炎症时还可出现发热、消瘦等全身症状且不能自愈。肛瘘术后创口易被粪便污染，一般不做缝合，因此创面修复成为影响预后的重要因素[1]。肛瘘创面修复主要包括炎症反应阶段、细胞增殖阶段及组织重塑阶段[2]，前两个阶段的发展走向直接影响肛周组织重塑。因此，减轻炎症反应，增快肛周组织细胞增殖，已然成为治疗肛瘘术后的研究方向和热点。

《医学流源论》指出：“外科之法最重外治”，说明外治法在治疗外科疾病方面占据着首要地位。肛门洗剂是肖慧荣主任医师通过多年研究而得，在临床中对肛瘘、混合痔术后创面愈合均有明确疗效[3-4]。肛瘘术后减轻早期炎症反应，重塑创面局部微循环，是提高肛瘘术后创口愈合率的关键因素[5-6]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)可促进细胞增殖、迁移、分化及血管再生。有研究证实，FGF诱导血管内皮增殖效应强于血小板生长因子[7]。本研究拟采用大鼠背部肛瘘造模法，观察肛门洗剂对肛瘘模型大鼠创面愈合及创面血流量的影响，并检测新生肉芽组织中血管生长相关因子、炎症相关因子、FGF的变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

高锰酸钾(济南福康生物制药有限公司)；氯胺酮(福建古田药业)；HE染色试剂盒(Solarbio公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；MI191型激光多普勒血流仪(上海埃德国际贸易公司)；VE-180型垂直板电泳装置(上海天能科技有限公司)；1703940型半干转膜仪、1708159型凝胶成像系统(美国Bio Rad公司)；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Assay公司)；白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)，白介素-2(interleukin-2， IL-2)ELISA试剂盒(中国欣博盛)；血管生长因子(vascular growth related factors，VEGF)、胎盘生长因子(placental growth factor， PLGF)、促血管生成素-Ⅰ(angiopoietin-Ⅰ，Ang-Ⅰ)、促血管生成素-Ⅱ(angiopoietin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)ELISA试剂盒(美国Cygnus公司)；低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)ELISA试剂盒(美国Abcam公司)；成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、成纤维细胞生长因子-6(FGF-6)一抗(美国Abcam公司)。

1.2 肛门洗剂组成及制备

肛门洗剂组成：五倍子60 g，苦参60 g，明矾20 g，朴硝20 g，桑寄生20 g，荆芥20 g，黄柏20 g，白及20 g，月石20 g，百部20 g，药物购自江西中医药大学附属医院中药房(批号20140101)。制法：将肛门洗剂原饮片粉碎成粗粉，加水 2 000 mL浸泡 15 min 后武火煮沸煎至500 mL，去渣存液，每150 mL 为1包，使用时按1∶4 稀释后擦洗创面，纱布包扎。

1.3 动物模型制备及分组

选取清洁级雄性SD大鼠64只，体质量(200±20)g，周龄8～10周，由江西中医药大学基础医学部实验动物中心提供(实验动物许可证号SCXK(赣)2017-019)。采用氯胺酮100 mg/kg腹腔注射进行麻醉，对入组大鼠术区备皮及消毒， 于颈后2.5 cm脊柱旁侧0.5 cm切割直径1.8 cm圆形创口，达肌层0.3 cm深度，止血后创面加粪液1 mL，油纱、敷料固定48 h，以创口有脓性分泌物、有粪臭者为成功标准[8]。将64只SD大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组、肛门洗剂组及阳性对照组各16只，对照组大鼠造成背部肌层创伤后不敷以粪便，模型组大鼠造模成功后不给予任何药物涂抹，正常组与模型组均给予0.9%NaCl溶液创面擦洗，每日2次；肛门洗剂组大鼠给予肛门洗剂药液擦洗创面，每日2次；阳性对照组给予高锰酸钾溶液(1∶5000)，每日2次，各组大鼠均连续干预14 d[9]。

1.4 创面愈合率

参照潘友珍等[10]方法测量创伤面积，并计算药物治疗7 d、14 d创面愈合率。愈合率=(原始创面面积-当前创面面积)/原始创面面积×100%。

1.5 创面局部血流量、新生毛细血管数检测

采用激光多普勒血流仪，将 MSP 200xp 表面探头放置在肛瘘内口创面上，每个创面分别选肛瘘内口的顶端及瘘道走向上任意2点(总计3个点)，每点记录30 s，采用 PowerLab Chart5 v5.2.2 图像分析软件进行图像分析，计算3点平均值作为该内口创面的血流值。实验第7天、14天取各组大鼠内口相近处肉芽组织，经10%甲醛固定液固定 45 min后，石蜡包埋、切片，行常规HE染色。采用光学显微镜对HE切片进行新生毛细血管数观察，并采用MPIAS-400 计算机彩色病理图文分析系统测定新生毛细血管总面积。

1.6 血管生长相关因子及炎症相关因子检测

于实验第7天，在各组大鼠中随机选取8只取部分肉芽组织，由于切取肉芽组织后影响药物干预14 d创口面积综合数据，取样后处死，其余大鼠于实验结束取材后处死。冷研磨后加入细胞裂解液2 mL制备组织匀浆，用ELISA法检测治疗7 d、14 d肉芽组织VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ、IL-1β、IL-2及PGE2表达，严格按照说明书操作。

1.7 创面组织FGF-1、FGF-2、FGF-6表达

剪取部分创面肉芽组织冷研磨后加入细胞裂解液，在4 ℃条件下以2000 r/min进行离心，测定蛋白量后制备上样液。取各组待测样品20 μg加至SDS-PAGE电泳中，转膜后脱脂牛奶封闭2 h，加入anti-FGF-1(1∶1000)、anti-FGF-2(1∶1000)、anti-FGF-6(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，洗膜3次加入二抗anti-rabbit(1∶1000)，24 ℃条件下孵育2 h，洗膜3次后暗室曝光扫描。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参β-actin灰度值。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠创面局部血流量、新生毛细血管数及其总面积

表1显示，与治疗7 d比较，治疗14 d正常组、肛门洗剂组及阳性对照组大鼠创面局部血流量、新生毛细血管数、总面积及创面愈合率均升高(P<0.05)；与正常组比较，模型组治疗7 d、14 d创面局部血流量、新生毛细血管数、总面积及创面愈合率均降低(P<0.05)；与模型组比较，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠治疗7 d、14 d创面局部血流量、新生毛细血管数、总面积及创面愈合率均升高(P<0.05)。

表1 大鼠创面局部血流量、新生毛细血管数及其总面积比较

注:与本组7 d时比较：*P<0.05；与正常组同时间点比较：#P<0.05；与模型组同时间点比较：▲P<0.05

2.2 血管生成相关因子VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表达情况

表2显示，与治疗7 d比较，正常组、模型组、肛门洗剂组及阳性对照组大鼠治疗14 d后创面肉芽组织VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表达升高(P<0.05)；与正常组比较，模型组治疗7 d、14 d创面肉芽组织VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表达降低(P<0.05)；与模型组比较，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠治疗7 d、14 d创面肉芽组织VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表达升高(P<0.05)。

表2 大鼠创面肉芽组织VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ含量变化比较

注:与本组7 d时比较：*P<0.05；与正常组同时间点比较：#P<0.05；与模型组同时间点比较：▲P<0.05

2.3 创面肉芽组织炎症相关因子IL-1β、IL-2及PGE2表达情况

表3显示，与治疗7 d比较，正常组、肛门洗剂组及阳性对照组大鼠治疗14 d创面肉芽组织IL-1β、IL-2及PGE2表达降低(P<0.05)；与正常组比较，模型组大鼠治疗7 d、14 d创面肉芽组织IL-1β、IL-2及PGE2表达升高(P<0.05)；与模型组比较，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠治疗7 d、14 d创面肉芽组织IL-1β、IL-2及PGE2表达降低(P<0.05)。

表3 大鼠肉芽组织IL-1β、IL-2及PGE2含量变化比较

注:与本组7 d时比较：*P<0.05；与正常组同时间点比较：#P<0.05；与模型组同时间点比较：▲P<0.05

2.4 各组大鼠创面肉芽组织FGF-1、FGF-2、FGF-6表达情况

图1表4显示，与正常组比较，模型组大鼠治疗7、14 d肉芽组织FGF-1、FGF-2及FGF-6表达降低(P<0.05)；与模型组比较，肛门洗剂组、阳性对照组大鼠7、14 d肉芽组织FGF-1、FGF-2及FGF-6表达升高(P<0.05)。

表4 大鼠创口肉芽组织FGF-1、FGF-2、FGF-6表达变化比较

注:与本组7 d时比较：*P<0.05；与正常组同时间点比较：#P<0.05；与模型组同时间点比较：▲P<0.05

注：A.正常组；B.模型组；C.肛门洗剂组；D.阳性对照组图1 大鼠创口肉芽组织FGF-1、FGF-2、FGF-6表达比较

3 讨论

中医认为，肛瘘病机多为肛痈溃后余毒未尽，结滞不散；或脏腑素虚，复感邪毒，气血壅结，肉腐成脓。因此，清热燥湿、补气化瘀的原则应贯穿肛瘘术后治疗的始终。肛门洗剂由五倍子、苦参、明矾、朴硝、桑寄生、荆芥碳、黄柏、白及、月石、百部等10味中药组成，方中重用五倍子收湿敛疮，苦参泻火疗创，合而为君；百部、明矾、黄柏协同增强苦参杀虫止痒功效，又燥湿清热；五倍子佐以荆芥炭、白及共行止血止痒之功；桑寄生、白及、朴硝联合可补益内虚的同时可生肌消肿，加速创面愈合。本研究显示，肛门洗剂可是肛瘘模型大鼠创面加速愈合，创口血流量、毛细血管数量明显升高，说明肛门洗剂可能通过某些机制增加创口毛细血管数量，给局部创面愈合提供足够血液，保障恢复创面的物质基础，增加创口愈合速度。

炎症与创口血运是影响肛瘘创面愈合的重要因素[11-12]，VEGF是目前已知的主要血管生长因子，HIF-1被认为是低氧条件时形成毛细血管的主要效能物质，并且HIF-1积累直接上调重要的促血管化因子VEGF[13-15]。近期研究发现，PLGF对微血管内皮细胞具有较强的促增殖作用，还可促进单核细胞及内皮细胞的游走，并增加内皮细胞的通透性[16]。Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ已被公认均参与创伤后病理性血管生成，并且在修复过程中起关键作用[17-18]。IL-lβ在急性炎症中起重要作用，它可激活内皮细胞或巨噬细胞的产生，可活化中性粒细胞，启动炎症级联反应[19]。IL-2又称T细胞生长因子，能够活化T细胞，促进细胞因子产生，促进B细胞增殖和分泌抗体，激活巨噬细胞[20]。PGE2作为重要的炎性介质，可以促进白细胞趋化，在伤害性刺激的局部迅速产生，并激活周围感觉神经末梢疼痛受体，强化痛感[21]。本研究发现，肛瘘模型大鼠创口肉芽组织VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ及Ang-Ⅱ表达降低，IL-1β、IL-2及PGE2表达升高，而经肛门洗剂治疗后上述血管生成相关因子及炎症因子表达均明显改善，说明肛门洗剂一方面可能通过降低炎症相关因子表达，减轻创面的充血与渗出，并可能通过降低PGE2表达起到一定的镇痛功效；另一方面，降低炎症因子表达后，减少杀伤和包围因子分泌，降低组织破坏程度，并促进血管生长相关因子的表达，加快血运重建，为组织修复阶段提供营养物质保障，从而达到加速创口愈合的作用。

为深入研究肛门洗剂促进肛瘘模型大鼠创口其他深层相关机制。本研究对创口新生肉芽组中FGF家族蛋白进行检测。FGF-1是第一个被确认的血管生长因子，可在细胞内进行重分部并分泌到细胞外与多种蛋白复合体进行装配，起到生成血管的作用[22]。FGF-2广泛存在于机体组织内，具有强烈的刺激细胞分裂增殖作用，对创面的修复起重要作用[23]。FGF-6在所有的肌源性组织中都有表达，Armand等通过研究发现，FGF-6既可刺激成肌细胞增殖、迁移，又可促进肌肉分化、肥大，对创口组织肌肉修复起重要作用[24]。结果显示，肛瘘模型大鼠创口肉芽组织FGF-1、FGF-2及FGF-6表达均下降，而肛门洗剂治疗后FGF蛋白表达回升，说明当出现创口时，可能由于炎症反应强烈，FGF家族蛋白表达被抑制，肛门洗剂则可通过影响FGF-1、FGF-2加速刺激血管内皮细胞分裂、增殖、排列，从另一角度说明肛门洗剂可促进肛瘘创口血管再生的机制；而肛门洗剂促进FGF-6的表达，则从肌肉再生角度证实肛门洗剂确有直接促进肌细胞增殖、加速创口愈合的作用。

综上所述，肛门洗剂提高肛瘘模型大鼠创口愈合率、创面局部血流量，其机制可能与降低创口新生肉芽组织炎症相关因子IL-1β、IL-2及PGE2表达，并提高血管生长相关因子VEGF、HIF-1、PLGF、Ang-Ⅰ、Ang-Ⅱ表达及FGF家族蛋白有关，为临床应用肛门洗剂治疗肛瘘补充可靠的科学依据，同时为进一步探索肛门洗剂相关药效奠定基础。