欧海荣 梁仔 龙霄翱 覃木秀 杨燕飞

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是神经系统肿瘤中等级和恶性程度最高的一种脑肿瘤，常常表现为在大脑皮质下浸润性生长，同时向肿瘤周边脑组织的侵袭和迁徙的能力较强，因此完全性切除困难，逃逸的肿瘤细胞极易引起术后的复发[1]。目前国内外研究表明GBM 患者的平均生存期小于2年，并且约40%的患者术后辅助放射治疗、化学治疗后生存期仍不能达到1年[2]。众所周知，GBM 术后的化学治疗对患者非常关键，目前临床上也强调术后尽早进行辅助放射治疗、化学治疗。然而，由于导致胶质瘤发生和发展的突变基因数量众多、类型复杂，临床中常用的替莫唑胺的化学治疗药并不能覆盖所有突变基因，因此治疗效果尚不能取得满意效果[3,4]。肿瘤个体化基因治疗是未来发展的方向，因此亟需不断完善肿瘤基因谱，为发现更多的药物靶点提供理论依据。本研究中的JAZF1 基因，已有报道指出其在前列腺肿瘤、子宫内膜间质肉瘤等肿瘤中异常高表达，且与肿瘤的恶性程度相关[5-7]。但是关于JAZF1 基因在胶质瘤中的作用研究报道少见，笔者对JAZF1 基因在不同级别胶质瘤中的表达及其表达对GBM 的侵袭和迁移的作用做了初步研究，现将结果报道如下。

材料与方法

一、细胞与试剂

人大脑GBM 细胞株U87M（美国ATCC 上海分公司）；JAZF1 干扰质粒（JAZF1 shRNA，sc-75335-SH）和空载对照质粒（Santa Cruze 公司，美国）；Matrigel（BD 公司，美国）；DMEM/F12 细胞培养基、胰蛋白酶、Lipofectamine 3000 （Invitrogen 公司，美国）；胎牛血清（fatal bovine serun，FBS）（Gibco 公司，美国）；RIPA 细胞组织裂解液和蛋白酶抑制剂（Takara 公 司，日 本）；JAZF1、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9、GAPDH 抗体（Abcam 公司，美国）；山羊抗兔IgG 辣根过氧化物酶标记（北京中杉金桥生物科技公司）；超敏ECL 和BCA 试剂盒（Thermo 公司，美国）；75%、95%的乙醇及甲醇生化实验材料等（上海生物工程公司）。

二、实验方法

（一）质粒的转染

JAZF1 干扰质粒 （JAZF1 shRNA，sc-75335-SH）和空载对照质粒以Lipofectamine 3000 作为转染试剂，操作方法按照厂家说明书进行。细胞的转染在细胞融合度约为60%时进行，质粒转染后，隔夜荧光显微镜下观察转染效率，约80%细胞转染成功后可继续进行后续实验。

（二）JAZF1 在美国癌症基因数据库中的资源

从TCGA 数据库（http://gliovis.bioinfo.cnio.es）中选择TCGA_GBMLGG 数据库，该数据库资料为全球可免费共享数据，不存在版权等利益冲突。在数据库中选择GliVis Explore，输入JAZF1 基因，并选择根据世界卫生组织胶质瘤等级分组（Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级），计算出数据库中胶质瘤患者中JAZF1 在不同级别胶质瘤中的mRNA 水平差异及不同表达水平时患者的中位生存期差异。

（三）U87M 细胞的体外Trans-well 侵袭实验

实验组细胞转染JAZF1 干扰质粒，对照组转染空载质粒。将用无血清培养基按1∶10 稀释后的Matrigel 涂于Trans-well 小室内的细胞生长面，将转染空载质粒组和转染干扰JAZF1 表达质粒的U87M细胞加入到小室内（5×105个/cm2），再用含10%FBS的RPMI 1640 培养基500 μL 加入Trans-well 下室。培养至12 和24 h 后，擦去Matrigel 和上室内细胞，多聚甲醛溶液（4%PFA）固定侵袭后细胞10 min，再以0.1%的结晶紫室温染色10 min，纯水轻柔漂洗3次后，将Trans-well 小室翻过来以底面朝上置于显微镜下拍照观察。

（四）U87M 细胞的体外细胞划痕实验

将U87M 细胞接种于6 孔板内，细胞生长至适宜密度后，以200 μL 枪头垂直6 孔板底部划痕，同时在实验组转染JAZF1 干扰质粒，对照组转染空载质粒。操作结束时间点为0 时，于0、12 和24 h 进行拍照观察。

（五）Western blot 方法检测蛋白表达量

细胞培养至预定实验时间点后，取出细胞培养皿放置于冰上，后续操作均在冰上进行。移液器小心吸出培养液，然后用4℃的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS） 溶液轻柔润洗细胞3遍后，弃去PBS，再加100 μL 细胞裂解液，在冰上裂解细胞30 min 后，提取细胞总蛋白，用Bradford 法测定蛋白质浓度。取100 μg 蛋白与Loading Buffer混合后，100℃高温煮沸10 min 以变性蛋白，然后用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至硝酸纤维素膜上，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（TBST 溶解）室温摇床封闭1 h，然后分别与JAZF1、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9、GAPDH抗体（GAPDH稀释比例为1∶5000，其余均为1∶1000，以5%BSA 稀释）等一抗在4℃冰箱内摇床过夜。次日，摇床上以TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相应种属的二抗（5%BSA 稀释，比例为1∶10 000）室温环境中孵育1 h，TBST 漂洗3 次，每次5 min，用ECL 化学发光试剂显色后使用化学发光型凝胶成像系统照相。蛋白相对表达强度=目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

三、统计学分析

采用SPSS20.0 软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，使用两独立样本的t 检验，生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、JAZF1 在高级别胶质瘤中的表达分析

为了研究JAZF1 在胶质瘤中的作用，对TCGA数据库中的620 例胶质瘤患者的全转录组数据进行研究，结果发现，在JAZF1 的mRNA 表达水平上，相较于Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤，Ⅳ级胶质瘤细胞中呈现高表达的趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1A）。同时，数据库中根据JAZF1 表达水平分为高低组的337 例患者（高表达169 例，低表达168 例）的生存曲线分析结果可见，JAZF1 高表达组患者的中位生存期为13.0 个月，而低表达组中位生存期为30.2 个月，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1B）。同时，对收集的临床肿瘤标本进行蛋白表达水平验证，结果发现，JAZF1 在蛋白的表达水平上与mRNA 水平一直在Ⅳ级胶质瘤中呈高表达，而在Ⅱ～Ⅲ级胶质瘤中呈低表达，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1C～D）。

图1 JAZF1 在胶质瘤中的表达及与患者生存期关系

二、JAZF1表达沉默后对GBM细胞株U87M侵袭和迁徙的影响

GBM 细胞株U87M 中转染特定短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA） 干 扰U87M细胞中JAZF1表达，JAZF1 蛋白表达量显著下降 （图2A）。JAZF1 表达下降后，Trans-well 实验和细胞划痕实验显示，U87M 细胞的侵袭和迁徙能力均显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2B～F）。

三、JAZF1沉默后p-AKT、MMP9、MMP2的表达下降

Western blot 实验结果发现，通过干扰质粒沉默U87M 细胞中JAZF1 的表达，JAZF1 的表达显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），此时促进肿瘤细胞侵袭和迁徙能力的相关关键蛋白MMP9、MMP2的表达水平也随之显著下调，同时调控MMP9、MMP2 的上游蛋白p-Akt 的表达下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05），而Akt 的表达变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

讨论

神经系统肿瘤中胶质瘤的治疗目前是神经外科疾病中非常棘手的问题，尤其是高级别的GBM，肿瘤发展迅速，肿瘤细胞极易向肿瘤周围脑组织侵袭和迁移，以至于外科手术难以将肿瘤完全切除，患者术后容易出现肿瘤的复发，再次手术效果较差[8,9]。目前，高级别胶质瘤的治疗强调个体综合性治疗，术后尽早进行放射治疗、 化学治疗能够延长患者的生存期，然而，国内外对高级别胶质瘤治疗的临床预后仍不尽如人意[10]。肿瘤的发病机制错综复杂，越来越多的相关致病突变基因被研究发现，目前临床使用的TMZ 并非对所有高级别胶质瘤都有疗效，高级别胶质瘤的靶向基因治疗也亟需个体化进行[11,12]。

图2 JAZF1 对U87M 细胞侵袭和迁徙的影响

图3 JAZF1 对侵袭和迁移相关调控蛋白表达的影响

JAZF1 是一个核蛋白编码基因，具有3 个C2H2 样锌指结构，对染色稳定性维持具有重要作用[13]。目前研究发现JAZF1 与子宫内膜间质肉瘤、前列腺肿瘤的发生有关[5]。本研究在美国脑肿瘤基因库TCGA_GBMLGG 平台中查找并分析了JAZF1在胶质瘤患者中的表达特征，数据计算结果显示JAZF1 在不同级别的胶质瘤患者中的mRNA 转录水平差异，在Ⅳ级胶质瘤肿瘤样本中JAZF1 的mRNA 转录水平显著高于Ⅱ、 Ⅲ级胶质瘤样本，而Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤之间无差别，提示JAZF1 很可能对Ⅳ胶质瘤的发生和发展具有一定的调控作用。众所周知，GBM 在胶质瘤中恶性程度最高，患者的中位生存期较低级别胶质瘤患者明显缩短，而数据库中患者的生存分析结果发现，高表达JAZF1 的胶质瘤患者的生存期显著缩短，进一步说明了JAZF1 在GBM 中有重要的病理生理功能。同时，我科收集的不同级别胶质瘤样本的JAZF1 蛋白水平的差异趋势和TCGA 数据库胶质瘤患者基因检测中JAZF1的mRNA 转录水平差异趋势一致。随后将GBM 细胞株U87M 细胞中的JAZF1 表达敲低，相比较于正常U87M 细胞，细胞内Akt 蛋白的磷酸化水平显著降低，并由此进一步抑制了调控肿瘤细胞侵袭和迁徙相关蛋白MMP9、MMP2 的表达水平，从而抑制U87M 细胞的侵袭和迁徙能力。本研究结果证实，JAZF1 可能参与了高级别胶质瘤的发生，并且对高级别胶质瘤细胞侵袭和迁徙能力的维持发挥了重要作用，成为一个新的治疗靶点。但是本研究也具有不足之处，目前的研究仅在细胞水平中得到初步研究，分子机制的研究尚浅，可能存在的更多分子信号通路的变化未发现，还需要进一步深入研究并且在裸鼠成瘤实验中进行体内相关验证[14]。

综上所述，JAZF1 在GBM 中呈高表达，且与患者的生存期呈负相关。JAZF1 通过调控Akt 的磷酸化水平进一步调控相应信号通路下游的MMP9、MMP2 的表达，从而影响GBM 的侵袭和迁徙能力，JAZF1 可能是一个GBM 治疗的新靶点。