杜丽洁 黄火强 张亚琛

【摘 要】 目的：优选艾纳香中总黄酮的提取工艺。方法：以乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数为因素，以总黄酮提取率为指标，采用正交试验优选提取工艺。结果：最佳条件为用16倍量的50%乙醇，提取3次，每次1.5h。结论：优选的工艺稳定、合理，可用于艾纳香中总黄酮的提取。

【关键词】 艾纳香;总黄酮;正交试验

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）1-0027-04

Abstract：Objective To optimize the extraction process of total flavonoids from Huang Yao（Blumea balsamifera DC.）of Yi Nationality.Methods With the concentration of ethanol， extraction time， ratio of material to liquid and extraction times as the factors， the extraction rate of total flavonoids was used as the index， and the extraction process was optimized by orthogonal test. Results The optimal conditions were as follows： 16 times the amount of 50% ethanol， extracted 3 times， each time 1.5h. Conclusion  The preferred process is stable and reasonable and can be used for the extraction of total flavonoids from Ayurveda.

Keywords： Blumea Balsamifera DC.; Total Flavonoids;Orthogonal Test

彝族“黄药”的中药名为艾纳香，又称为大风艾、牛耳艾、大骨风、冰片艾等，为菊科艾纳香属植物艾纳香（BLumea baLsamifera DC.）全草[1]，主要分布在云南、贵州、广西、广东等地[2]。艾纳香最早记载于公元741年陈藏器所编著的《本草拾遗》：“主癣避蛇”，由于疗效确切，在历代本草等相关文献中均有关于艾纳香用途、用法及疗效等方面的记载[3]。艾纳香以其全草或地上部分入药，其性味苦、温、辛，主要有祛风除湿、活血调经、消肿止痛等功效[4]。彝医认为其性味苦，入脾、肺气路，有清热解毒、逐瘀化痰的功效，在中国西南彝族地区被广泛应用于抗肿瘤，尤以抗肺癌效果为佳[5]。

文献报道，艾纳香的主要成分为黄酮和挥发油，同时也含有少量的苷类成分，其中黄酮类成分的研究最為广泛。目前报道的黄酮类物质主要为黄酮（醇）类、二氢黄酮类和查尔酮类三大类[6-10]。其药理作用也主要集中在黄酮类物质的作用上，具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎以及保肝等活性[11-13]。为合理利用彝族“黄药”艾纳香植物中的黄酮类化合物，需要优化对其进行最大化提取分离的方法。目前已有学者对“黄药”艾纳香的总黄酮提取工艺和含量测定进行了考察，黄永林等[14]采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，对艾纳香叶、小枝条、茎中总黄酮含量进行了测定，结果显示叶中总黄酮含量最高为2.94%，小枝条含量最低只有1.21%。罗夫来等[15]用紫外分光光度法测定总黄酮含量，以提取率为指标，用正交实验方法优选艾纳香最佳提取工艺。和银霞等[16]用超声波提取方法考察了艾纳香的提取工艺，并测定不同部位总黄酮的含量。课题组前期研究结果[17]表明，艾纳香的黄酮成分主要富集在二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位。本研究在罗夫来等[15]研究基础上考察了提取次数对总黄酮提取率的影响，并利用正交设计实验选取乙酸乙酯萃取部位对彝族“黄药”艾纳香中总黄酮进行考察，以期找到最佳的提取工艺，为更好地开发利用艾纳香并发挥其药用价值提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AdventurerOHAUS电子天平，UV1700PC紫外可见分光光度计（上海凤凰光学仪器有限公司）。

1.2 药材 “黄药”为菊科艾纳香属植物艾纳香的干燥茎、叶，购自河北安国药材市场，经DNA条形码鉴定为真品。

1.3 试剂 芦丁对照品（北京百灵威科技有限公司）。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯。

2 方法

2.1 艾纳香中总黄酮测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品15.1mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得到0.151mg/mL对照品溶液。

2.1.2 标准曲线绘制精密 吸取芦丁对照品溶液0、1、2、4、6、8mL，分别置于25mL的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min;10% AL（NO3）3溶液1mL，摇匀，放置6min;4% NaOH溶液10mL，摇匀，静置15min，加水至相应刻度。在510nm处测定各溶液的吸光度。以质量浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程A=11.278C+0.0275，R2=0.9992。表明芦丁在0.00604～0.04832mg/mL与吸光度线性关系良好。标准曲线如图1。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取艾纳香药材2.0g，根据正交试验设计用不同体积分数的乙醇按不同的料液比、不同的加热时间以及不同加热次数进行回流提取，滤过，收集滤液，减压浓缩成浸膏。将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉。精密称取萃取物干粉25.0mg置于25mL容量瓶中，充分溶解后，做供试品溶液（浓度为1mg/mL）待用。

2.1.4 精密度试验 称取艾纳香药材2.0g，用80%的乙醇按料液比为15∶1加热回流3次，每次3h，收集滤液，减压浓缩成浸膏。将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉。精密称取萃取物干粉25.0mg置于25mL容量瓶中，充分溶解后，做供试品溶液待用。精密量取2mL供试品置于25mL容量瓶中，按“2.1.2”项下处理，测定吸光度，连续测定5次，计算吸光度RSD值为0.515%，表明仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验 称取同一批艾纳香药材5份，按“2.1.4”项下制备供试品溶液，精密量取2mL供试品置于25mL容量瓶中，其余的步骤按“2.1.2”項下方法进行显色处理，测定吸光度值，结果吸光度值得RSD值为1.035%。

2.1.6 稳定性试验 精密量取2mL供试品置于25mL容量瓶中，其余步骤按“2.1.2”项下方法加显色剂显色进行处理，分别在0、5、10、15、20、25、30min测定其吸光度值，计算RSD值为0.5627%，样品在30min内稳定性较好。

2.1.7 加样回收率试验 称取同一批艾纳香药材1.0g，按“2.1.4”项下制备供试品溶液，精密量取5份2mL供试品溶液置于25mL容量瓶中，分别加入0.151mg/mL的芦丁对照品2mL，其余的步骤按“2.1.2”项下方法进行显色处理，测定吸光度值，结果平均回收率为97.3%，RSD值为0.753%。

2.1.8 总黄酮的测定 取艾纳香药材按“2.1.3”制备供试品溶液，按“2.1.2”项下方法进行显色处理，测定吸光度值，代入回归方程，计算总黄酮的含量。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 对乙醇浓度设5个浓度梯度即40%、50%、60%、70%、80%。精密称取艾纳香全草2.0g，置于100mL三角瓶中，加相应浓度乙醇 40mL，70 ℃水浴回流提取3次，每次 2h，提取液过滤，合并浓缩得浸膏，将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉，精密称取萃取物干粉25mg置于25mL容量瓶中，按“标准曲线的制备”项下方法显色后，测吸光度，根据“2.1.2标准曲线”回归方程计算总黄酮含量和提取率。

由图2可知，当乙醇浓度小于 50% 时，随着乙醇浓度的增大，总黄酮提取率程增加趋势; 当乙醇浓度为 50% 时，总黄酮提取率最高; 此后，再增加乙醇浓度，总黄酮提取率反而下降，因此，确定乙醇浓度为 50% 左右较为合适。

2.2.2 提取时间对总黄酮提取率的影响 考察提取时间的影响，设置5个时间梯度，即0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h。精密称取2.0g艾纳香全草，置于100mL 三角瓶中，加50 %乙醇 40mL，70 ℃ 水浴回流至规定时间，提取液过滤，共提取3次，合并浓缩得浸膏，将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉，精密称取萃取物干粉25mg置于25mL容量瓶中，按“标准曲线的制备”项下方法显色后，测吸光度，根据“2.1.2标准曲线”回归方程计算总黄酮含量和提取率。

由图3可知，当提取时间小于1.5h时，随着提取时间的延长，总黄酮提取率程增加趋势;当提取时间为1.5h左右时，总黄酮提取率最高;此后，再延长提取时间，总黄酮提取率反而略微下降。因此，确定提取时间为1.5h左右较为合适。

2.3 因素水平的选择 根据预实验以及相关文献研究选取影响艾纳香回流提取的乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取次数（C）和提取时间（D）为考察因素，选用L9（34）正交试验表筛选最佳工艺。见表1。

2.4 正交试验 取艾纳香药材2g，按照设计的实验方案进行提取，滤过，减压浓缩得浸膏，浸膏水溶液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，浓缩冻干成干粉。称取相应质量的萃取物粉末，配置成供试品溶液，测定其吸光度值，根据芦丁标准曲线方程计算艾纳香总黄酮百分含量。以该结果列入正交设计表中进行统计。

2.5 验证试验 称取3份艾纳香药材各2g，按照上述优选的最佳工艺进行提取，萃取得到萃取物干粉，照上述建立的测定方法条件测定，计算艾纳香药材中总黄酮提取率。结果艾纳香药材中总黄酮的提取率分别为2.74%、2.81%、2.77%，平均值为2.77%，RSD值为1.27%。结果表明所选工艺合理、稳定、可行。

3 讨论

测定黄酮含量目前最常用的方法是紫外-可见光分光光度法（比色法），是被测物质在适当的显色剂显色后，在特定波长处或一定波长范围内的测定吸光度或发光强度，从而对该物质进行定性和定量分析的方法[18]。总黄酮含量的测定往往采用芦丁作对照品，经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色后，在510nm处测定吸光度值[14]。

实验选择对总黄酮提取率影响量较大的乙醇浓度、料液比、提取时间以及提取次数为4个主要因数，采用正交实验法优化艾纳香的总黄酮提取工艺。实验结果可知，提取次数对艾纳香中总黄酮的提取影响最大，其次为乙醇浓度、提取时间和料液比。最终优选的工艺条件为采用16倍量的50%的乙醇提取3次，每次提取1.5h。该工艺验证，3次提取结果的总黄酮提取率RSD值为2.0%，说明该工艺重复性良好，且总黄酮提取量最大，因此确定为最佳提取条件，为后续的艾纳香研究实验作为参考。随着临床研究的进一步发展，艾纳香中总黄酮的药理作用及作用机制将进一步被阐释说明，本实验得出的最佳提取工艺将对彝族“黄药”艾纳香的深度开发利用提供了可靠的实验依据。

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（收稿日期：2018-11-14 编辑：陶希睿）