李利红，魏志华，吕乐园，赵建平，李慧娟

(河南牧业经济学院 制药工程学院，河南 郑州，450046)

板栗(Castanea Mollissima Blume) 为山毛榉科或壳斗科植物，在我国南北各地广泛栽培，约占世界总产量的83%[1]。河南是我国重要的板栗种植地区，每年产生大量的板栗壳，但缺乏有效利用。研究表明，板栗壳色素稳定、无毒、清除自由基能力强[2]，具有抗衰老、药理保健等功能。板栗壳资源丰富，成本低，源于天然，将其开发为绿色饲料添加剂应用于畜牧业，具有广阔的发展和应用前景。本试验采用正交设计，对超声辅助碱法和乙醇法提取板栗壳的工艺进行优化，并测定其中的黄酮类和酚类成分含量，研究其抑菌活性，为板栗壳的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

板栗购自郑州市姚桥农贸市场，剥肉取壳备用。

1.2 仪器与试剂

超声波清洗仪(SYU-22-600DT，郑州生元仪器有限公司)，旋转蒸发仪(R-1001-VN，郑州长城科工贸有限公司)，离心机(LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂)，分光光度计(VIS-7220G，北京瑞利分析仪器公司)，万分之一天平(BT125D，赛多利斯)，立式高压灭菌锅(LDZM-60K，上海审安医疗器械厂)，超净工作台(JH-SCB，上海鸿都电子科技有限公司)，生化培养箱(SPX-300BSH，上海新苗医疗器械制造有限公司)，台式冷冻恒温振荡器(THZ-Q，太仓市华美生化仪器厂)。

沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均由河南牧业经济学院动物医学院实验室提供。

试剂：乙醇、氢氧化钠、没食子酸等均为分析纯。芦丁标准品(上海士锋生物科技有限公司，批号10471，纯度98%)，多西环素原料(河北久鹏制药有限公司，A201710038)，MH(B)培养基、LB琼脂、LB培养基(北京奥博星生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺的正交设计 采用L9(34)正交设计，见表1和表2。

表1 提取的因素及水平

1.3.2 提取流程

(1)超声辅助乙醇法 称取板栗壳720 g，分成9组，按照表1和表2的设计进行提取，每组重复提取三次，离心，过滤，提取液浓缩，干燥，称重(W)。

(2)超声辅助碱法 称取板栗壳720 g，分成9组，分别按照表1和表2的设计进行提取，每组重复提取三次，离心，过滤，提取液浓缩，干燥，称重(W)。

表2 正交设计

1.3.3 提取物得率计算 提取物得率 %= W /壳重量×100%。

1.3.4 验证试验 称取板栗壳150 g，分成3份，按优选的超声辅助乙醇法最佳工艺条件进行提取；称取板栗壳150 g，分成3份，按优选的超声辅助碱法最佳工艺条件进行提取；称取板栗壳150 g，分成3份，按照煎煮法(提取三次，分别为1.5 h，1 h，0.5 h)进行提取。

1.3.5 提取物主要成分含量测定 取1.3.4的提取物进行含量测定。

(1)总酚含量测定 根据2010版药典[3]附录ⅩB测定。

(2)总黄酮含量测定 根据2010版药典[3]附录ⅥD测定。

1.3.6 抑菌活性 取乙醇法和碱法提取物，按照文献[4]方法测定抑菌活性。

1.3.7 数据处理 试验数据用Excel软件和正交设计助手V3.1进行处理。

2 结果与分析

2.1 超声辅助乙醇法正交试验结果

正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 超声辅助乙醇法提取的得率

由表4可见，根据极差(R)的大小, 超声辅助乙醇法工艺参数中影响板栗壳提取物提取率的4个因素的主次顺序为：乙醇浓度(A)>提取时间(C)>提取温度(B)>溶剂用量(D)。直观分析得出组合A1B2C2D2的提取率最高，达5.875%，工艺条件为：乙醇浓度30%，提取温度25 ℃，提取时间40 min，溶剂用量8倍,由表5方差分析可知，4个因素均不具有显著影响。

表4 超声辅助乙醇法方差分析

2.2 超声辅助碱法正交试验结果

正交试验结果见表5,方差分析结果见表6。

表5 超声辅助碱法提取得率

表6 超声辅助碱法提取方差分析

由表5可见，根据极差(R)的大小,超声辅助碱法工艺参数中影响板栗壳提取物提取率的4个因素的主次顺序为：pH值(A)>提取时间(C)>提取温度(B)>溶剂用量(D)。直观分析得出组合A1B3C3D3的提取率最高，达6.738%，工艺条件为：pH=9，提取温度35 ℃，提取时间30 min，溶剂用量10倍。由表6方差分析可知，4个因素均不具有显著影响。

2.3 最佳工艺验证试验结果

按照优选的超声辅助乙醇法工艺组合A1B2C2D2和超声辅助碱法工艺组合A1B3C3D3进行提取，板栗壳提取物提取得率分别为5.66%(2.83 g)和6.52%(3.26 g)，煎煮法提取得率为4.96%(2.48 g)，超声辅助乙醇法和碱法提取的得率均比普通煎煮法高。

2.4 板栗壳提取物中主要成分含量测定

最佳工艺条件下，板栗壳提取物中总酚和总黄酮含量的测定结果见表7。

表7 板栗壳总酚和黄酮含量

由表7可见，不同工艺条件下，板栗壳提取物的主要成分含量差别很大。碱法提取物中总酚和总黄酮含量均最高，共35.92%，煎煮法提取物含量略低(32.96%)，乙醇法提取物含量最低(20.2%)。

2.5 板栗壳提取物抑菌活性测定结果

对板栗壳提取物的抑菌活性测定结果见表8。

表8 板栗壳碱提取物的抑菌圈 单位：mm

由表8可看出，板栗壳碱提物对兽医临床上的常见菌具有一定的抑菌活性，而对沙门氏菌的抑制效果最差。0.1 g/mL提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别达13 mm、11 mm和13.5 mm；0.1 g/mL的提取物与抗生素11混合使用后，均比同浓度下的抗生素单独使用抑菌效果稍好，即提取物与抗生素联用，具有增强抗生素抑菌效果的作用。

3 讨论

3.1 板栗壳提取物提取工艺研究

研究表明，板栗壳提取物的溶剂从乙醇到乙酸乙酯都有，工艺条件差别较大。周国燕等用超声波乙醇提取法的最佳工艺条件为：10倍量40%乙醇、200 W功率超声波作用时间8 min，90 ℃提取2.5 h[5]。吴春华等在微波条件下用20倍量40%乙醇，75℃微波辐照13 min,板栗壳提取物的得率为7.02%[6]。曾超珍等板栗壳提取工艺条件为：30倍乙酸乙酯，70 ℃ 浸提4 h[7]。苏云霞等用15倍68%乙醇、65 ℃提取75 min、粗提物经AB-8大孔树脂分离和乙酸乙酯-石油醚混合溶液萃取后得板栗壳原花青素。李汉春等用40%乙醇添加0.4%纤维素酶，353 K下提取60 min，提取板栗壳色素[8]。

在不同溶剂和不同工艺条件下，板栗壳提取物中的成分类型和含量不同。与文献相比，本试验以总酚和黄酮为提取对象，在超声波条件下采用低浓度乙醇和碱水做溶剂，经优化，溶剂用量少(8至10倍)、提取时间短(乙醇法40 min，碱法30 min)，提取温度低(均不超过40 ℃)的优点，提取物得率大于5%，其中乙醇法提取物中总酚和黄酮量为20.2%，碱法提取物中总酚和黄酮量为35.92%，煎煮法提取物中总酚和黄酮量为32.96%。

3.2 板栗壳提取物抑菌活性研究

周国燕等发现板栗壳色素对枯草芽胞杆菌、大肠杆菌和黑曲霉具有抑制作用，对苹果汁有一定的防腐效果[5]。曾超珍等研究表明，板栗壳提取物有较强的热稳定性，能耐短时的高温处理，在pH值7～9的范围内具有较强的抗菌活性，对大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草杆菌的最低抑菌浓度分别为0.125、0.0625、0.125 mg/mL[7]。韦琴等研究发现，板栗壳原花青素抑菌效果由大到小依次为:啤酒酵母菌>金黄色葡萄球菌>白色念珠菌，MIC依次为0.120、0.958、3.831 mg/mL[9]。

本试验是在板栗壳提取物对兽医临床常见菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果的基础上，探讨板栗壳提取物与抗生素联用的效果，结果表明，添加板栗壳提取物可以减少抗生素用量，并增强抗生素的抑菌效果。