王静，胡笑文，白利平，张苗青，张靖溥，江冰娅，孙桂芝，黎林丽，李书芬，张玉琴，刘红宇，余利岩，武临专

放线菌具有丰富的次级代谢产物合成能力。珍贵束丝放线菌 ATCC 31565（简称 ATCC 31565）是抗肿瘤抗生素——安丝菌素（ansamitocin）生产菌株[1]。该菌株还产生四氢异喹啉类生物碱化合物 dnacins、环肽类化合物 actinosynneptides 和含色氨酸的二酮哌嗪类化合物等[2-4]。

在优化培养条件提高安丝菌素发酵效价的研究中，对 ATCC 31565 产生的脂溶性代谢产物进行了挖掘，发现并鉴定了一个新化合物，经 NMR 解析等确定其化学结构为鼠李糖苷化的 1,4-二羟 基-2-萘甲酸甲酯，并将其命名为珍贵酚，并对其生物合成途径进行了推测。

自噬是真核细胞维持自身生理稳态的一种机制，是不被使用的细胞组分和受损细胞器被降解与再利用的一种基本过程。由于越来越多的天然产物被发现具有调节（激活或抑制）自噬活性，对珍贵酚是否具有调节自噬活性进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 珍贵束丝放线菌 ATCC 31565（CPCC 203294），由本实验室保藏。

1.1.2 培养基 种子培养基：酵母提取物 4.0 g/L、麦芽提取物 10.0 g/L、葡萄糖 4.0 g/L、琼脂粉 15.0 g/L，pH 自然；发酵培养基：糊精 50.0 g/L、麦芽糖 20.0 g/L、棉籽饼粉 25.0 g/L、玉米浆 1.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、NaCl 2.0 g/L、琼脂粉 20.0 g/L，pH 7.0。

1.1.3 化学试剂和色谱柱 高效薄层色谱层析板（HSGF254）为烟台市化学工业研究所产品；MCI 色谱柱填料为日本三菱化学公司产品；分析型色谱柱 Diamonsil C18(2)（150 mm × 4.6 mm，5 μm）为北京迪科马科技有限公司产品；半制备型 HPLC 色谱柱 YMC-Pack ODS-AQ（250 mm × 10.0 mm，S-5 μm）为日本 YMC 公司产品；甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯等分析纯试剂为北京化工厂产品；色谱纯甲醇和乙腈为赛默飞世尔科技公司产品；纯净水为深圳屈臣氏蒸馏水有限公司产品；抗 ATG5 抗体 NB110-53818 为美国Novus Biologicals 公司产品；抗 ATG7 抗体 8558S 为美国 Cell Signaling Technology 公司产品。

1.1.4 仪器 HPLC-20A 高效液相色谱仪为日本岛津公司产品；Eyelan-1100 型旋转蒸发仪为日本 Eyela 公司产品；Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS 质谱仪购自安捷伦科技（中国）有限公司；AVIIIHD 600 核磁共振仪为德国 Bruker 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 ATCC 31565 培养与发酵 将冷冻保藏的 ATCC 31565 孢子悬液均匀涂布于种子培养基平板，28 ℃ 培养 5 d。将种子培养基平板上的孢子用无菌水洗下，振荡后得孢子悬液。将该孢子悬液接种于发酵培养基平板（约 1000 个，50.0 L），28 ℃ 培养 8～10 d，收集发酵培养物，用于目标化合物分离纯化。

1.2.2 TLC 和 HPLC 发现珍贵酚 将 ATCC 31565 发酵培养物（45～55 ml）切成小块，用二倍体积乙酸乙酯提取 2 次，每次 24 h；合并提取液并减压旋蒸得到粗提物，用 0.5 ml 乙酸乙酯复溶，取 10 μl 进行硅胶板 TLC 分析，展开系统为二氯甲烷-甲醇（10:1）；将目标条带刮下后用乙酸乙酯提取，提取液经真空浓缩干燥后复溶于甲醇，进 行 HPLC 分析，流动相为 25%～50% 乙腈-水 （30 min），检测波长 254 nm。

1.2.3 珍贵酚的分离纯化 ATCC 31565 发酵培养物 50 L，用约 2 倍体积乙酸乙酯萃取2 次，减压旋蒸后得到粗提物 185 g；粗提物上 MCI 色谱柱进行分离，流动相为 45%、55%、65%、100% 乙醇，阶式梯度洗脱，将 65% 洗脱馏分合并旋蒸得到粗品 427 mg；粗品用甲醇复溶后采用半制备 HPLC（流动相为水和甲醇，洗脱条件为 65% 甲醇等度，流速 1.5 ml/min，出峰时间为 45 min）纯化，得到珍贵酚纯品 8.7 mg。

1.2.4 珍贵酚的 NMR 测定 取珍贵酚纯品约 1.0 mg，溶于甲醇中，在室温条件下进行高分辨质谱分析。取珍贵酚纯品约 5.0 mg，溶于氘代 DMSO 中，在室温条件下进行 1D 和 2D NMR 测定。

1.2.5 珍贵酚中的鼠李糖鉴定 称取纯化的珍贵 酚样品，用甲醇配制成 1.0 mg/ml 溶液，取 20 μl 点样于玻璃片上，平放于装有浓盐酸的密闭玻璃缸中，60 ℃ 水浴锅中加热 1 h，取出玻璃片，用水将样品轻轻洗下，点样于硅胶板上，同时点样珍贵酚、L-鼠李糖和L-岩藻糖，作为对照。正丁醇-丙酮-水（4:3:1）为展开系统，展开结束后用 10 % 硫酸溶液喷雾，85 ℃ 加热显色[5-6]。

1.2.6 调节自噬活性测定[7]将培养于含 10% FBS、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 HepG2 细胞，用不同终浓度（1、5、10 和 20 μmol/L）的珍贵酚处理 24 h 后，在含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 细胞裂解缓冲液中进行裂解。裂解得到的蛋白用 12% SDS-PAGE 分离并转移到硝 酸纤维素膜上后，用抗 ATG5 和抗 ATG7 抗体进行孵浴。

2 结果

2.1 目标化合物的发现

ATCC 31565 的乙酸乙酯提取物在 TLC 分析时，在紫外 254 nm 下出现一条蓝色荧光条带。将该条带刮下，提取其中的化合物并进行 HPLC 分析，发现在 215、254 和 356 nm 处有吸收峰 （图1）。质谱分析提示其中的化合物分子量为 364（m/z 365 [M+H]+）。

ATCC 31565 的发酵培养物约 50 L，经乙酸乙酯提取后，采用 MCI 色谱柱和半制备 HPLC 分离纯化，得到该目标化合物纯品 8.7 mg。

图1 ATCC 31565 产生的珍贵酚的 HPLC 图 Figure 1 HPLC chromatogram of pretiphenol from ATCC 31565

2.2 化学结构确定

目标化合物为淡黄色无定形粉末。根据 HRESIMS 数据（m/z 365.1227，[M+H]+），推测其分子式为 C18H20O8（理论分子质量 364.1231，误差 -1.08 ppm）。

在1H NMR 谱中，包含属于 1 个邻二取代苯环上的 4 个偶合质子共振信号δH8.11（1Hd，J= 8.4，H-6）、7.77（1H，t，J = 7.2 Hz，H-7）、7.66（1H，t，J = 7.2 Hz，H-8）和 8.32（1H，d，J = 8.4 Hz，H-9），1 个苯环上质子单峰信号δH7.33（1H，s），1 个甲氧基质子信号δH3.98（3H，s），以及 1 个活泼氢的质子信号δH11.58（1H，s）；此外，1H NMR 谱中的δH5.47、δH1.13 d（6.0）和δH3.52～5.12 之间的质子共振信号表明存在 1 个脱氧己糖基（表1）。

表1 目标化合物的 NMR 数据 Table 1 The NMR data of target compound

在13C NMR 谱中，一共有 18 个碳信号、 10 个芳香碳、1 个羰基碳、1 个氧甲基碳、1 个甲基碳、4 个含氧次甲基碳信号和 1 个端基碳信号。根据 HMBC 和1H-1H COSY 信号，10 个芳香碳来自一个萘环结构，而 4 个含氧次甲基、1 个甲基和 1 个端基质子的1H-1H COSY 关联进一步证实含有 1 个脱氧己糖基（表1）。因此，推测珍贵酚可能属于糖苷化的萘酚类化合物。

图2 目标化合物(珍贵酚)的结构及其 1H-1H COSY 相关和主要的 HMBC 相关信号 Figure 2 The structure and key 1H-1H COSY and HMBC correlations of target compound (pretiphenol)

图3 TLC 鉴定目标化合物中的L-鼠李糖 Figure 3 The identification of L-rhamnose from target compound by TLC

目标化合物的羟基活泼氢δH11.58 与 C-2 和 C-10 有关联（图2），来自萘环上 sp2杂化的次甲基氢（H-9，δH8.32）与 C-1 有关联，证明该羟基连接在 C-1 上。来自氧甲基的氢（H3-12，δH3.98）与羰基碳（C-11，δC170.2）有关联，表明是一个甲酯基团，C-3 位的芳香氢（H-3，δH7.37）与甲酯的羰基碳（C-11，δC170.2）和芳香碳（C-4，δC143.5） 有关联，表明 C-2 位连接了甲酯基团。C-6 位的氢（H-6，δH8.11）与脱氧己糖的端基质子信号 （H-1'）有关联，并同时与一个低场区烯烃碳（C-4，δC143.5）有关联，提示 C-4 位连接了糖苷。根据天然产物中出现的脱氧己糖种类，推测 C-4 连接的脱氧己糖为 L-鼠李糖（L-rhamnose）或 L-岩藻糖（L-fucose，即6-脱氧-L-半乳糖），且前者的可能性更大，因为有报道 ATCC 31565 产生含鼠李糖的代谢产物[8]。对珍贵酚进行酸解反应，TLC 分析鉴定所释放出来的糖基，证明是 L-鼠李糖（图3）。

因此，目标化合物的化学结构确定为 1-羟 基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯（methyl 1-hydroxy-4-O-rhamnosyl-2-naphthoate，图2）。考虑到该化合物为珍贵束丝放线菌产生的萘酚类新化合物，所以将其命名为珍贵酚。

图4 推测的珍贵酚生物合成途径 Figure 4 The plausible biosynthetic pathway for pretiphenol

2.3 生物合成途径推测

珍贵酚由 1,4-二羟基-2-萘甲酸甲酯和鼠李糖两部分组成。其中的结构单元 1,4-二羟基-2-萘甲酸是甲萘醌（menaquinone，细菌细胞膜成分）生物合成途径中的一个中间产物，据此推测其生物合成源于分支酸（chorismate）；L-鼠李糖也是细菌中常见的一种 6-脱氧己糖，其生物合成源于葡萄糖。因此，推测珍贵酚是 1,4-二羟基-2-萘甲酸和L-鼠李糖的脱水缩合产物再经过甲酯化形成的（图4）。通过对 ATCC 31565 基因组 DNA 序列的生物信息学分析，确定了负责 1,4-二羟基-2-萘甲酸和 L-鼠李糖生物合成的基因，以及可能负责催化二者脱水缩合的糖基转移酶。

2.5 珍贵酚的生物活性

经珍贵酚处理的 HepG2 细胞，虽然细胞中的部分自噬相关蛋白例如 ATG5 和 ATG7 的表达水平显著下降，但没有发现它具有调节细胞自噬活性的作用。

3 讨论

经 SciFinder 数据库检索，确定珍贵酚为新化合物。珍贵酚属于在 1,4-二羟基-2-萘甲酸骨架基础上首次发现的 L-鼠李糖苷化的天然产物。同时，它也是从珍贵束丝放线菌 ATCC 31565 中发现的一个新代谢产物。

已知植物产生 1,4-二羟基-2-萘甲酸的葡萄糖苷化衍生物。例如，从小红参（Rubia yunnanensis）中分离得到 1-羟基-4-O-葡萄糖-2-萘甲酸及其甲 酯[9]，从胡桃楸（Juglans mandshurica）中分离得到 4,8-二羟基-1-O-葡萄糖-3-萘甲酸乙酯[10]。这些天然产物均与珍贵酚的化学结构相似，但未见报道这些化合物的生物活性。

1,4-二羟基-2-萘甲酸来自费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii），具有抑制骨重吸收作用[11]；该化合物也是一种感光材料和染料中间体，可通过化学合成[12]。1-羟基-2-萘甲酸甲酯具有抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症响应作用[13]，珍贵酚与该化合物具有一定的结构相似性（都含有萘酚结构单元），因此本文作者也测定了珍贵酚对小鼠巨噬细胞（RAW264.7 细胞系）的效应，但没有发现它具有抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症响应活性。因此，今后还需要进一步探索或研究珍贵酚的生物活性。