张佳音，王启宇，梁 红，孙凯霞，张治国

(1.哈尔滨学院工学院，哈尔滨 150086；2.哈尔滨师范大学物理与电子工程学院，哈尔滨 150025；3.哈尔滨工业大学凝聚态科学与技术研究所，哈尔滨 150001)

1 引 言

光动力疗法作为肿瘤的一种微创性治疗方法，受到了广泛关注[1-2]。与临床上常用的肿瘤治疗方法(手术、化疗、放疗)相比，光动力疗法具有更高的选择性，微创性，无并发症等优势[3-5]。光动力疗法包含三个要素：光、光敏剂、及氧气。当特定波长的光激发光敏剂会产生活性氧(ROS)，可以杀死肿瘤细胞[6-7]。其中，光敏剂是实施高效的光动力治疗过程的关键因素。传统光敏剂卟啉类衍生物已经进入了光动力疗法的临床应用。然而传统光敏剂的激发光在可见光谱范围内，组织对这部分光的吸收很强，激发光在组织中的穿透深度较差，导致光动力疗法只适用于表皮性肿瘤的治疗[8-9]。

生物组织在近红外区750～1000 nm范围内有“光学透过窗”[10,11]。组织对这部分光的吸收和散射很弱，在组织中的穿透深度很深。所以人们一直在开发近红外光激发的光敏剂。双光子过程可以实现近红外光激发，可实现深组织激发[12]。然而，双光子激发的荧光材料吸收截面小，需要较高能量的脉冲激光激发，超出了临床应用的安全范围[13]。2007年，Zhang等[14]提出了利用上转换纳米粒子结合传统光敏剂开展光动力疗法，实现了980 nm近红外光激发的光动力疗法。具体地，980 nm近红外光激发Yb3+离子，通过能量传递上转换过程使Er3+的高能激发态布局，然后Er3+产生的540 nm上转换荧光激发传统光敏剂，传统光敏剂再与O2发生作用，产生ROS的过程。虽然上转换光动力过程将激发光波长转移到了近红外区，但是上转换光动力疗法需要复杂的能量传递过程，引入了很大的无辐射弛豫损耗，效率较低[15-16]。同时，光敏剂载药和释放可控性差，阻碍临床应用[17]。

最近，NaYbF4纳米晶作为一种新型的近红外激发的无机光敏剂被提出。Yb3+激发态能量(1.27 eV)稍高于ROS的激发态能量(0.97 eV)，在980 nm光的激发下，处于激发态Yb3+可将能量传递给O2，形成ROS。NaYbF4纳米晶作为光敏剂具有近红外光激发，能量传递效率高、稳定性好、无需载药可控性好等优点，有实现临床应用的潜质[18]。本文针对NaYbF4纳米晶这一新型纳米晶的光物理化学性质进行优化。NaYbF4纳米晶的ROS的产生速率很可能和纳米晶与氧之间的接触面积有关，这里我们通过调节纳米晶的尺寸，来改变纳米晶的比表面积，探究NaYbF4纳米晶的尺寸的调节来探究NaYbF4纳米晶的尺寸对ROS产生速率的影响，得到优化的NaYbF4纳米晶，提高ROS产生效率。

2 实 验

2.1 仪器与试剂

六水氯化镱YbCl3·6H2O(99.9%，购买于Sigma-Aldrich)，油酸 (纯度≧99%，购买于Sigma-Aldrich)，十八烯(纯度90%，购买于Sigma-Aldrich)，氮气(购买于哈尔滨黎明气体有限公司，99.999%)，甲醇、环己烷和乙醇(购买于天津富宇化学试剂公司，分析纯)，氢氧化钠NaOH(纯度≧98%，购买于Sigma-Aldrich)，氟化铵NH4F(纯度≧98%，购买于Sigma-Aldrich)。

2.2 样品的制备方法

纳米晶制备采用热解法，这种合成方法可实现对纳米晶的形貌、尺寸及晶相的可控合成，具体的合成过程参考已报道过的方法[19]：首先，将1 mmol的YbCl3·6H2O，6 mL油酸和15 mL十八烯放入三口瓶中，通入氮气作为保护气，将反应液搅拌加热到160 ℃，恒温1 h，反应液变澄清，此时认为YbCl3·6H2O完全溶解。然后，将反应液降温至50 ℃，注入NaOH(0.1 g)和NH4F(0.148 g)的甲醇混合液 10 mL，在此温度恒温搅拌30 min，进一步加热到80 ℃，蒸发掉反应液中的甲醇和水分。最后，将温度升高至纳米晶的形成温度300 ℃，恒温一段时间。关闭加热装置，自然冷却到室温，在反应液中加入乙醇，使纳米晶沉淀，然后5000 r/min离心，离心后的粒子进一步用环己烷和乙醇的混合溶液清洗，将表面多余的离子和油酸清洗掉，反复清洗三遍，将离心出的裸核纳米晶分散在环己烷中保存。

2.3 测量方法

利用FEI Tecnai TF20测量制备的NaYbF4纳米晶TEM图像。利用QE65000 (Ocean Optics, USA)光纤光谱仪对吸收光谱进行测量。1,3-二苯基异苯并呋喃(1,3-diphenylisobenzofuran，DPBF)作为荧光探针。 利用氘灯作为光源，在不同的光照时间下，采集样品溶液中DPBF在可见区的透过光谱。最后根据Beer-Lambert定律计算DPBF的吸收光谱。

2.4 吸收光谱检测DPBF浓度理论

根据化学探针DPBF检测ROS理论，在ROS产生过程中，DPBF浓度随时间的变化可以被描述如下：

(1)

其中，[DPBF] 和 [ROSi] 分别是 DPBF 和 ROSi的浓度；ki为ROS与DPBF之间的能量传递速率；k是DPBF的消耗速率或者描述成DPBF随时间衰减的衰减常数的倒数。

根据方程(1)，将式子两边积分，溶液中DPBF的浓度可以被描述成如下形式：

[DPBF]=[DPBF0]e-kt

(2)

通过观察DPBF浓度的变化，就可以说明是否产生了ROS。

将方程(2)，将两边取对数，可以得到k，即可以获得ROS产生速率，可以用来评价样品产生ROS的快慢。

k=ln([DPBF]/[DPBF0])/t

(3)

其中，[DPBF]利用溶液中DPBF的吸收系数A来评价，根据Beer-Lambert定律，透射光谱强度可以描述如下：

It=I0exp(σ[DPBF]L)

(4)

其中，σ为样品的吸收截面；L为光源在样品中的路径。

A=σ[DPBF]L∝ [DPBF]

(5)

根据方程(4)与(5)，A用来评价溶液中DPBF浓度的变化，可以描述成如下形式:

A=ln(I0/It)

(6)

3 结果与讨论

3.1 NaYbF4纳米晶形貌表征

利用热分解法制备，通过调节纳米晶生长的时间来控制纳米晶粒径的大小，将生长时间分别控制在10 min、30 min、50 min、70 min、90 min，制备NaYbF4纳米晶，其TEM照片如图1所示，10 min时，晶核刚刚形成，形态并不很明显，平均粒径在1 nm。当生长时间达到30 min时，晶核的形态逐渐形成，平均尺寸大约在4 nm左右。生长时间达到50 min时，纳米晶的形貌较规则，尺寸也变得较均一，平均粒径为8 nm。增长恒温时间到70 min，平均粒径尺寸达到20 nm。当恒温时间到90 min，发现晶粒生长的很饱满，其平均尺寸在28 nm。

图1 不同反应时间的NaYbF4纳米晶的TEM图像Fig.1 TEM images of NaYbF4 nanocrystals at different reaction time

3.2 NaYbF4纳米晶分散液中DPBF吸收光谱的测量

测量NaYbF4纳米晶的ROS产生速率，需调节不同尺寸NaYbF4纳米晶浓度相一致，在相同浓度下，比较尺寸这一变量对NaYbF4纳米晶ROS产生速率的影响。测量不同粒径NaYbF4纳米晶(不同反应时间的纳米晶)分散液中不同光照时间下DPBF吸收光谱。将DPBF溶解在环己烷溶液中，然后不同粒径NaYbF4纳米晶分散液加入DPBF溶液，采用的NaYbF4纳米晶的浓度约为5 mg/mL，DPBF的浓度为20 μmol/L，利用980 nm激发光进行光照，光功率为1.3 W，每间隔20 min对分散液中DPBF的吸收光谱进行测试。图2 (a-e)给出了不同粒径NaYbF4纳米晶分散液，不同光照时间的DPBF的吸收光谱。从光谱中可以看出，无论粒径尺寸大小，在980 nm激发光照射下，NaYbF4纳米晶都可以使DPBF吸收光谱产生下降，说明不同尺寸的纳米晶均可产生ROS，但发现不同粒径纳米晶分散液中DPBF浓度的变化速率不同。

图2 NaYbF4纳米晶分散液中DPBF的吸收光谱，其中的NaYbF4纳米晶生长时间不同(a)10 min；(b)30 min；(c)50 min；(d)70 min；(e)90 minFig.2 The absorption spectra of DPBF in solutions of NaYbF4 nanocrystals with different growth time (a)10 min；(b)30 min；(c)50 min；(d)70 min；(e)90 min

3.2 影响ROS产生速率的机制研究

图3 不同尺寸的NaYbF4纳米晶分散液中DPBF的消耗速率Fig.3 Consumption rates of DPBF in solutions of NaYbF4 nanocrystals with different sizes

图4 NaYbF4纳米晶的尺寸与DPBF的消耗速率之间的关系Fig.4 Relationship between consumption rates of DPBF and sizes of NaYbF4 nanocrystals

根据DPBF的吸收光谱，可计算ROS产生速率(k)，k正比于ROS产率，ROS产率是评价光敏剂性能的重要指标[20]。图3给出了不同尺寸的NaYbF4纳米晶分散液的k，随着纳米晶尺寸的变化k也发生明显的变化。图4建立了k和NaYbF4纳米晶尺寸之间的关系。发现纳米晶尺寸小于8 nm时，其k随着尺寸的增加而逐渐增加，继续增大纳米晶的尺寸，k开始下降。k很可能受两种因素的影响，一方面受纳米晶比表面积的影响，比表面积越大，Yb3+与O2之间的接触几率越高，能量传递效率增加，k增大。另一方面受晶体质量的影响。当生长时间较短时，虽然纳米晶尺寸较小，与周围环境中氧的接触几率增加，但是由于生长时间较短，其晶格中的畸变和晶格缺陷较多，导致了多声子辅助的无辐射弛豫很多，会影响Yb3+激发态能级与O2之间的跃迁几率，进而影响k。图4表明相对于大尺寸的NaYbF4纳米晶，小尺寸NaYbF4纳米晶的k较高，这表明小尺寸纳米晶的比表面积大，增加了Yb3+与O2的接触，提高了二者间的能量传递效率。同时，在小尺寸范围内，随着尺寸的增加，k缓慢增加，很可能由于纳米晶尺寸增加，晶体质量提高，晶体中的缺陷减少，增加了Yb3+激发态能级向O2之间的跃迁几率，导致k增加。尺寸大于8 nm时，k降低明显，这主要因为纳米晶的尺寸增加，减少了Yb3+与O2之间的相互作用机会，导致了低的k。实验结果表明NaYbF4纳米晶尺寸在8 nm 左右活性氧产率最高，相对其它尺寸更适合光动力疗法应用。

4 结 论

利用热解法制备NaYbF4纳米晶，通过控制纳米晶的生长时间，可以调节纳米晶的尺寸。生长时间为90 min、70 min、50 min、30 min、10 min时，NaYbF4纳米晶尺寸分别为1 nm、4 nm、8 nm、20 nm、28 nm。进一步探究了NaYbF4纳米晶尺寸对其k的影响，结果表明纳米晶尺寸在Yb3+与O2的能量传递过程中占主导因素。但晶体生长中的晶格缺陷通过影响Yb3+激发态能级的辐射性质，影响k。当NaYbF4纳米晶尺寸在8 nm时，其k最大，相对其它尺寸更适合开展光动力治疗。