孙豪娴，孙贵香，肖 丹，邓琳蓉，张 婷，厉佳俊

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

颗粒膏是以新型配方颗粒为原材料，运用现代科技工艺制作而成。不仅疗疾以缓，功效滋补，而且携带方便，口感较好。颗粒膏的产生不仅解决了传统膏剂制作繁琐的问题，还节约了人力、物力资源。然而关于颗粒膏的功效一直是患者心中的困惑，且目前研究报道较少。本实验通过复制脾气虚模型大鼠来研究颗粒剂四君子膏对大鼠心肌结构、SOD、MDA的影响，并对四君子膏于大鼠心肌的保护作用进行探讨。旨在以四君子膏为参考，对颗粒剂运用于膏剂制作上的功效做出评价，为临床上颗粒剂膏的运用提供参考。

1 材料和方法

1.1 动物、药物、试剂与仪器 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180±20 g，购自湖南中医药大学，合格证号：SYXK（湘）2013-0005。在湖南中医药大学实验动物中心进行实验，实验室内温度控制在18～22℃，相对湿度维持在40%～70%。

颗粒剂四君子膏溶液：颗粒剂四君子膏由人参、茯苓、白术、炙甘草等组成，由深圳华润三九医药有限公司提供配方颗粒，以《太平惠民和剂局方》为依据，四种药物以3∶3∶3∶2的比例溶解浓缩，加入炼蜜收膏而成。再参照《人与动物用药量换算表》70 kg成人的体表面积是200 g大鼠的56倍，按照正常成人一日服用膏滋40 g计算，3组大鼠服用的膏剂量分别为1.8、3.6、5.4 g/kg，将膏剂加蒸馏水分别制成含膏量为180、360、540 g/L的溶液，并放入冰箱储存备用。四君子汤溶液：同颗粒剂四君子膏药物组成比例，按书中原方剂量，采用传统中药煎煮方法煎煮至含生药量为295 g/L的溶液保存。大黄制剂液：由大黄煎煮浓缩至生药浓度为54 g/L而成。实验中所用的中药饮片亦由深圳华润三九医药有限公司提供。大鼠超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自长沙鼎国生物技术有限公司（货号：INS20180187）。

JE1002电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；WMY-01数字温度计：上海医用仪表厂；低温高速离心机：美国sigma公司；EL34oi型全自动酶标仪：Molecular Devices公司。

1.2 动物模型复制 参考文献[1-4]，采用饮食失节+耗气破气+劳倦过度的方法建立脾气虚动物模型。实验过程中采取隔日进食的方法控制大鼠进食量；每日上午按10 mL/kg灌服大黄制剂；在水温为（22±2）℃的室内游泳槽中，每天下午强迫负重（按大鼠自身体重的10%计）游泳至力竭为止——大鼠鼻尖没入水面大于10 s。

1.3 动物分组与给药 SD大鼠60只，适应性喂养3 d后依次编号，采用国际上通用的编号表计，随机分为正常组、模型组、四君子汤组、四君子膏低、中、高剂量组。正常组自由饮食，除同时灌服等量生理盐水外不做特殊处理；实验组在隔日进食、灌胃大黄制剂、负重游泳的基础上，于每日下午各组分别灌服2 mL等量生理盐水、四君子汤（2.95 g/kg）及颗粒剂四君子膏低、中、高剂量（1.8、3.6、5.4 g/kg）溶液，连续给药28 d。

1.4 指标检测 大鼠腹主动脉取血后开胸，夹取心脏，立即用低温生理盐水洗去残留血液，滤纸吸干后于心尖处切取约1 mm×1 mm×1 mm的心肌组织，用多聚甲醛溶液固定，经酒精脱水处理后石蜡包埋，制备显微镜切片，常规HE染色，光学显微镜观察心肌组织结构变化并摄影。剩余心肌组织准确称重后低温离心，制成心肌匀浆液，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，均严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，数据资料以“均数±标准差（±s）”表示。运用单因素方差分析法进行组间比较，采用LSD法和Dunnett法进行两两比较，取α=0.05为检验水准。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠活动灵敏，毛发有光泽，肛温正常，体重逐日增加；模型组大鼠造模1周后出现稀便，便次增多，继而出现体形瘦弱，蜷缩不好动，反应迟钝，毛发蓬松无光泽，体重、肛温均明显低于正常组（P＜0.05），符合脾气虚证的症状，参照田茸等[5]制订的脾气虚证模型大鼠的评分标准：倦缩扎堆1分；眯眼弓背1分；食量减少1分；体质量减轻1分；便形质软1分；便形溏稀2分；肛温下降2分；游泳耐力下降1分。模型组大鼠得分为7分，大于5分，提示造模成功；四君子汤组、四君子膏低、中、高剂量组大鼠症状较模型组均有所减轻（P＜0.05），四君子膏组呈现出剂量趋势；四君子汤组大鼠肛温及体重变化与四君子膏中、高组存在差异（P＜0.05），见表 1。

表1 各组大鼠肛温、体重情况（±s，n=10）

表1 各组大鼠肛温、体重情况（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与四君子汤组比较，▲P＜0.05

▲四君子膏高剂量组 5.4 37.92±0.24△▲ 254.47±6.01△▲

2.2 各组大鼠心肌组织SOD、MDA水平 相较于正常组，模型组大鼠心肌组织SOD活力水平显著降低，MDA含量显著升高（P＜0.05）；4组给药组较模型组大鼠心肌SOD活力均升高，心肌MDA含量均降低（P＜0.05），并以四君子膏高剂量组最明显；四君子膏中、高剂量组对提高大鼠心肌组织的SOD活力、降低MDA含量的作用强于四君子汤（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠心肌组织SOD、MDA水平（±s，n=10）

表2 各组大鼠心肌组织SOD、MDA水平（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与四君子汤组比较，▲P＜0.05

MDA/（nmol·mg-1）正常组 - 69.57±2.20 0.79±0.11组别 剂量/（g·kg-1）SOD/（U·mg-1）模型组 - 41.17±1.50* 1.42±0.06*四君子汤组 2.95 51.27±5.80*△ 1.19±0.13*△四君子膏低剂量组 1.8 51.42±4.59*△ 1.07±0.07*△四君子膏中剂量组 3.6 54.32±2.20*△▲ 1.03±0.07*△▲四君子膏高剂量组 5.4 65.53±3.15△▲ 0.85±0.10△▲

2.3 各组大鼠心肌结构比较 在400倍光镜下观察各组大鼠心肌组织HE切片，其中正常组大鼠心肌组织纤维排列整齐有序，心肌细胞大小、形态正常，染色均匀，周围未见炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌组织纤维排列紊乱，部分组织正常结构消失，心肌细胞肥大、坏死，细胞间质增宽，间质细胞增多，水肿严重，周围可见炎性细胞浸润；给药组大鼠心肌组织结构损伤均较模型组轻，其中四君子汤组及四君子膏低剂量组心肌组织间质增宽，存在轻度水肿、排列紊乱；四君子膏中剂量组心肌组织染色均匀，排列较整齐，存在轻度水肿；四君子膏高剂量组心肌组织与正常组相近，见图1。

3 讨论

3.1 脾气虚证大鼠模型的建立和评价 动物造模的成功与否是决定实验的关键，在近几十年的研究过程中，脾气虚证动物模型的建立从单因素造模的方法发展到现在普遍的复合因素造模的方法[6]。本实验采用饮食失节、耗气破气结合劳倦过度的复合因素造模。脾胃为水谷之海，后天之本，脾胃功能的正常有赖于饮食规律节制，饮食失节，饥饱失常，则脾胃损伤。大黄味苦性寒，具有泻下攻积，清热泻火之效，而《本草经疏》云：“脾虚忌下、降泄、破气”，采用灌服大黄制剂液耗气破气后，大鼠可出现明显脾气虚症状[7]。张景岳云：“脾胃之伤于外者，惟劳倦最能伤脾”，脾胃为气血生化之源，而劳倦易散气耗气，因此采取力竭游泳的方法使大鼠劳倦过度，可以较好建立脾气虚证的动物模型[8]。实验证明，采用上述3种因素联合进行造模后，大鼠出现肛温下降、体重减轻、饮食量减少、大便偏稀、蜷缩畏寒等症状，符合脾气虚证的表现。四君子汤出自《太平惠民和剂局方》具有益气健脾的功效，是治疗脾气虚证的基础方[9]。本实验结果表明，大鼠灌服四君子汤后一般情况较模型组大鼠好，脾气虚症状得以改善，有是证用是方，根据“方证对应”的逻辑理论[10-11]，说明所造模型为脾气虚证模型。

3.2 四君子膏对脾气虚模型大鼠心肌组织结构及SOD、MDA的影响 心肌组织结构的改变可以很直观的反映心肌细胞的损伤程度，有学者发现脾气虚大鼠心肌细胞存在不同程度的坏死[12]。SOD是生物体内存在的一种抗氧化酶，具有清除自由基，防止自由基损伤的作用，有研究表明SOD可以减轻组织的氧化应激损伤，保护心肌缺血再灌注损伤[13]。MDA是体内脂质过氧化作用的代谢产物，其含量的多少可以反映脂质过氧化的程度[14]。本实验研究结果显示，模型组大鼠心肌损伤明显，心肌组织SOD活力水平显著降低，MDA含量显著升高，说明大鼠经脾气虚造模后清除自由基能力减弱，心肌组织产生较多氧自由基受到损伤。经四君子制剂治疗后各组大鼠情况均有所改善，其中四君子膏的效果在低浓度时与四君子汤相同，在中、高浓度时优于四君子汤，在高浓度时效果最好，说明四君子膏的功效值得肯定，颗粒剂四君子膏可以提高脾气虚证大鼠心肌组织SOD活力，降低MDA含量，增强大鼠心肌组织抗氧化能力及自由基清除能力，减轻脾气虚证大鼠心肌组织损伤。

图1 各组大鼠心肌组织（HE 400×）

3.3 探讨四君子膏对脾气虚模型大鼠心肌的保护作用 心者，君主之官，神明出焉；脾胃者，仓廪之官，五味出焉。《内经》书中载：“五脏相通，移皆有次”，心与脾之间存在着密切联系，后世医家对其进行了总结与延展，认为二者的关系主要体现在：母子相依：在五行上心属火，脾属土，二脏存在着母子相生、母子互病的关系；气血互济：“食气入胃，浊气归心，淫精于脉”《素问·经脉别论》），心主血脉，脾胃为气血生化之源，心与脾在气血上存在互济的关系；经脉相贯：“脾足太阴之脉也……其支者，复从胃，别上膈，注心中”，心脾二脏通过经脉相贯，联系互通；病理互制：基于心脾二脏间上述关系的特殊性，因此在病理上相互影响[15]。

四君子汤是治疗脾气虚证的一首基础方，现代药理学研究表明，方中的有效成分主要为多糖、皂苷、黄酮及挥发油类物质[16]，具有促进消化吸收、增强机体免疫、促进内分泌腺功能、延缓衰老等作用[17-19]。颗粒剂四君子膏则是以四君子汤为依据，由配方颗粒药材以最新工艺熬制而成，既保留了四君子汤健脾益气之功，又具备了膏剂滋补保健之效[20-21]。本实验研究发现，脾气虚证大鼠在出现脾气虚症状的同时，其心肌组织亦存在较明显损伤。而四君子膏可以通过提高心肌组织SOD活力，降低MDA含量，减少心肌损伤，从而达到对心肌组织的保护作用。《脾胃论》载“内伤脾胃，百病由生”，脾病及心，子病及母。实验结果从另一方面说明了心脾二脏之间的关系性，同时为临床“从脾论治”心系疾病提供了理论依据。

综上可知，采用饮食失节+耗气破气+劳倦过度复合因素的方法可以建立良好稳定的脾气虚大鼠模型。基于心脾二脏之间的生理、病理联系，脾气虚证模型大鼠心肌细胞存在损伤，心肌组织中的SOD活力水平下降，MDA含量升高。四君子制剂可以保护脾气虚证大鼠的心肌组织结构，其中颗粒剂四君子膏的疗效值得肯定，并在一定浓度上优于四君子汤。临床上颗粒剂不仅可以运用于汤剂，亦可运用于膏剂的制作。