孙 燕 ，张露蓉 ，2△，姚 霏 ，2，陈 江

（1.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 2150092.苏州市吴门医派研究院，江苏 苏州 215009）

肝癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一，病死率在肿瘤中居第2位[1]。由于肝癌的恶性程度及侵袭性高，多数患者确诊时已经为中晚期[2]，使得治疗形势不容乐观[3-5]。中医认为，阳气亏虚、湿热聚毒、气滞血瘀等是肝癌发生的病理基础[6]，具有寒、湿热、瘀等特点。中医药治疗寒、湿、瘀之病症，注重辨证施治、扶正驱邪、调理气机，以达到补阳散寒、祛湿化瘀解毒的功效[7]。

薏苡附子败酱散在《金匮要略·疮痈肠痈浸淫病脉证并治》中有所记载，方中包括薏苡仁、附子、败酱草3味药，具有破瘀散结，温补阳气的功效[8-10]，常用于由寒、湿、瘀所致的多种疾病的治疗[11-14]。这与肝癌的发病机理所对症。此外，有文献报道君药薏苡仁中的有效成分薏苡仁油可以抑杀肝癌细胞，并已制成康莱特注射液供临床上使用[15]；附子提取物对移植性肝癌H22细胞的生长具有抑制作用[16]；黄花败酱总皂苷、总黄酮类亦对肿瘤有一定的抑制作用[17]。可见，从中医病因和单味药角度，薏苡附子败酱散可拓展应用于肝癌的治疗。临床上，对肝癌的治疗虽未见报道，但应用此方加味联合化疗治疗大肠癌颇有成效[18]。因此，本文围绕薏苡附子败酱散，探讨其抗肝癌的效应及有可能的作用机理，为该方临床用于抗肝癌提供实验依据，亦为临床合理使用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 仪器基础电泳仪电源（北京百晶生物技术有限公司）；酶标仪（Molecular Devices公司）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；凝胶成像分析系统（美国ProteinSimple公司）。

试剂 DMEM培养液（GIBCO公司，批号：1993895）；胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司，批号：18120503）；胰蛋白酶（闪晶生物公司，批号：2594141）；二甲亚砜（天津DAMAO化学试剂厂，批号：20150906）；顺铂（齐鲁制药有限公司，批号：AA1A8028B）；四甲基偶氮唑盐（BioFROXX公司，批号：EZ2811A179）；Annexin V-PE 细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司，批号：20180518）；BCA蛋白含量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010）；ECL检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180228）；β-actin（CMCTAG 公司，批号：1832NJ）；Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体（Cell Signaling公司，批号分别为：0012，0037，0005，0005）。

药材 薏苡仁（批号产地：190306河北）；附片（黑顺片）（批号产地：190306四川）；败酱草（批号产地：190306河北）。购自于苏州市春辉堂药业有限公司。

细胞株及动物 小鼠肝癌细胞株Hepa1-6由苏州大学生命科学院馈赠。SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，购自苏州昭衍新药研究中心有限公司，动物生产许可证号：SCXK（JING）2014-0004。

1.2 药液制备 按经方比例称取薏苡仁30 g，附子6 g，败酱草15 g，按照 8倍量纯水冷浸30 min，回流提取1 h，倾出药液；药渣再按6倍量加入纯水，回流提取30 min，倾出药液。将两次药液进行减压浓缩，最终至生药含量1 g/mL，冷藏备用。

1.3 荷瘤小鼠模型建立及给药 参照实验室建立的方法制备荷瘤小鼠模型[19]：用 PBS把Hepa1-6肝癌细胞密度调整为1×107个/mL，然后取0.2 mL的细胞悬液接种于C57 BL/6小鼠的腋下，建立模型。种瘤8～10 d之后观察成瘤情况。将成瘤小鼠分为模型组、顺铂阳性药物组（5 mg/kg），薏苡附子败酱散低、高剂量组（7.735、15.47 g/kg），每组6只小鼠。灌胃给药，持续14 d，每天1次，最后1次给药12 h后，处死小鼠，测定瘤重。抑瘤率 =［1-（给药组瘤重/对照组瘤重）］×100%。

1.4 细胞培养 Hepa1-6肝癌细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 DMEM（pH 7.0）完全培养基，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每24 h更换1次培养液，待细胞生长至对数生长期时，用0.25%胰酶进行消化、传代，取第3～4代对数生长期的Hepa1-6细胞用于实验。

1.5 MTT检测细胞活力 将对数生长期的Hepa1-6细胞，接种于96孔板。分别加入不同生药浓度（10、20、30、40、50 mg/mL）的薏苡附子败酱散药液并作用24、48、72 h。以不加药物为空白组，顺铂（50 μg/mL）为阳性药物组。加入MTT后培养4 h，弃去上清，加入DMSO，在酶标仪490 nm得到吸光度OD（λ）值。细胞增殖抑制率=［（1-给药组OD值/对照组OD值）］×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 将Hepa1-6肝癌细胞接种于6孔板，给药组分别加入不同生药浓度的薏苡附子败酱散（10、20、30、40、50 mg/mL），空白组不加药，培养48 h后分别加入Annexin V和FITC进行染色，流式细胞仪检测。

1.7 Western blot检测 取对数生长期的Hepa1-6肝癌细胞，接种于6孔板。给药组分别加入30、40、50 mg/mL生药浓度的薏苡附子败酱散，空白组不加入药物，培养48 h。裂解，离心，提取蛋白，用BCA法定量；SDS-PAGE电泳；PVDF膜转膜，封闭；一抗（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，TBST漂洗，二抗（1∶1 000）室温孵育 1 h，TBST漂洗；ECL 曝光、显影。以β-actin为内参，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 薏苡附子败酱散体内外对Hepa1-6细胞的抗肝癌效应 观察薏苡附子败酱散在体内抗肿瘤作用时发现，与模型对照组瘤重（1.83±0.72）g相比，7.735、15.47 g/kg薏苡附子败酱散组瘤重分别为（1.21±0.33）g 和 （0.79±0.33）g，抑瘤率分别为 （33.78±17.85）%、（56.95±18.17）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着薏苡附子败酱散剂量的增加，瘤重减小，抑瘤率增大，表明薏苡附子败酱散对Hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤的生长具有抑制作用，见图1A、1B。

从体外对Hepa1-6肝癌细胞增殖抑制的实验中发现，随着给药浓度以及作用时间的增加，抑制率增加，并呈一定的剂量-时间依赖关系，见图1C。以上结果表明薏苡附子败酱散体内外均具有抗肝癌效应。

图1 薏苡附子败酱散体内外对Hepa1-6细胞的抗肝癌效应

2.2 薏苡附子败酱散对Hepa1-6细胞凋亡的影响 为了探究薏苡附子败酱散的抗肝癌机理，检测了对Hepa1-6细胞凋亡的影响。结果显示，与空白对照组相比，随着薏苡附子败酱散浓度的增加，凋亡率逐渐上升，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明薏苡附子败酱散可促进Hepa1-6细胞凋亡，并有剂量依赖性，见图2。

图2 薏苡附子败酱散对Hepa1-6细胞凋亡的影响

2.3 薏苡附子败酱散对Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 由于薏苡附子败酱散对Heap1-6细胞具有促凋亡作用，因此随后检测了凋亡相关蛋白的表达情况。发现与空白组相比，随着薏苡附子败酱散浓度的增加，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3 表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降（见图3A、3B），Bax/Bcl-2值上升（见图3C），差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明薏苡附子败酱散通过调控凋亡相关蛋白的表达来促进肝癌细胞凋亡，见图3。

图3 薏苡附子败酱散对Hepa1-6细胞中凋亡蛋白表达的影响

3 讨论

肝癌在中医药史上属于“癥瘕”“胁肋胀痛”等范畴[20]，历代医家对其有一定的记录，如“肝脉微急为肥气，在胁下”“伏梁，环脐而痛”等[21]，并认为肝癌是由正虚邪实、内外交争引起的，阳气不足、瘀毒湿热是形成肝癌的病因[22-23]。薏苡附子败酱散中薏苡仁和败酱草化湿消肿散结、泻火解毒化瘀，再加上附子性热味辛、助阳祛寒，通达经络，行郁滞之气，增强薏苡仁和败酱草的渗湿、除瘀、散结之功，共达散寒助阳、化瘀祛湿之效[24]。现代药理学研究发现，该方有消炎止痛、抑制肿瘤生长的功效[24-25]，并且方中3味单药均有抗肝癌效应[15-17]，提示薏苡附子败酱散在抗肝癌方面有应用潜能。因此，在应用C57 BL/6荷瘤小鼠模型评价该方的体内抗肝癌效应时，发现该方可以降低荷瘤小鼠的瘤重，抑制肿瘤生长。通过体外细胞实验表明，该方能够抑制Hepa1-6细胞增殖，体现出一定的肝癌抑制效应。综上结果，表明该方对肝癌的生长具有抑制作用。

诱导肿瘤细胞凋亡是抗肝癌机制之一[26-27]。研究表明，肝癌细胞在体内外因素的影响下，经过相关信号转导通路的调控，使细胞发生特性改变从而诱导凋亡[28]。从流式细胞术结果中发现，薏苡附子败酱散可诱导肝癌细胞凋亡，说明该方通过促进细胞凋亡来抑制增殖。Bcl-2家族中Bcl-2和Bax分别为抑制和促进凋亡的两个核心蛋白[29]，Bax/Bcl-2值是判断线粒体外膜通道稳定与否和细胞凋亡发生与否的重要评判标准[30]。Caspases家族有10个成员，分为凋亡起始者和执行者[31]。其中Caspase-3具有抑制剂特异性，降解PARP、DFF-45，抑制DNA的修复并启动DNA的降解，参与细胞凋亡的执行[32]；而Caspase-3活化产生的cleaved Caspase-3，其表达程度可反映Caspase-3的活性和细胞凋亡情况[33]。进一步研究其促凋亡作用机制，发现薏苡附子败酱散组可使Bax表达升高，Bcl-2表达下降，Bax/Bcl-2值上升，同时可调控Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表达，且有剂量依赖效应。综上表明，薏苡附子败酱散可能通过调控线粒体凋亡途径诱导Hepa1-6肝癌细胞发生凋亡。

本研究结果显示，薏苡附子败酱散动物体内能抑制肿瘤生长，体外能抑制Hepa1-6细胞增殖，并且诱导肝癌细胞凋亡。其机制可能与调控Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白表达相关。本研究为薏苡附子败酱散抗肝癌的临床应用提供了实验依据，但是，薏苡附子败酱散抗肝癌具体机制和特点尚未完全阐明，另外，给药途径为口服的中药复方，本文只用水提液进行体外细胞试验，对于评价其临床活性还有所欠缺。因此薏苡附子败酱散抗Hepa1-6肝癌细胞生长作用未来能否转化为临床用于肝癌的治疗还需要进一步研究。