范祺祺 董 文 熊兴耀 王万兴 秦玉芝 何长征 胡新喜*

（1湖南农业大学园艺园林学院，2011南方粮油协同创新中心，湖南省马铃薯工程技术研究中心，湖南长沙 410128；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

植物花色苷作为一种较优良的脂质过氧化抑制剂和氧游离基清除剂，具有一定的营养价值和药理功效。被子植物的花色形成多与花色苷有关，它可引导生物传粉、抵御紫外线伤害、诱导共生菌的植入，是植物生长过程中不可或缺的次生代谢物质。由于其存在的普遍性、天然性，使得花色苷成为制作可食用色素、化妆品着色剂、保健品等商品原材料的首选。

花色苷主要以水溶物的形式存在于植物体细胞液泡中，特异性积累在植物的不同器官上，多积累于植物（如茄子、辣椒）的地上器官花、果实、种子中，具有含量高但总产量小、不易储存的特点。与地上器官相比，植物地下器官花色苷具有总产量高、抗逆性强、受环境因素影响较小、具有较好的光稳定性和热稳定性等优点。花色苷等植物次生代谢产物的合成和积累受遗传的控制，不同作物种类和品种的次生代谢产物种类和含量不同，同时次生代谢产物合成也受光照、温度、水分、养分等环境因子的影响。探明这些因素对植物次生代谢产物合成和积累的调控作用机理，对通过遗传改良和改进栽培措施提高作物的次生代谢物产量具有重要的指导意义，能够满足人类对重要次生代谢产物的巨大需求。为加速高花色苷含量的品种选育及其应用，解析花色苷在马铃薯、紫甘薯、紫淮山等植物块茎、块根中生物合成调控的分子机制已成为科学家关注的热点。本文对国内外植物花色苷特别是地下器官花色苷的种类、生物合成及调控机制进行了综述，并展望了今后的研究重点。

1 植物花色苷及种类

彩色马铃薯、紫甘薯、紫淮山等植物块茎、块根富含强抗氧化活性物质花色苷。花色苷在结构上属于类黄酮化合物，2-苯基苯并吡喃阳离子衍生物，以C6-C3-C6高度分子共轭体系为基本骨架（图1），糖苷结合于C3或（和）C5、C7位上，形成花色苷。花色苷类型多种多样，结构复杂，除了发生糖苷化的数目和位点（C3、 C5、C7）差异，结合酰基的结构、数量和位置也会导致花色苷种类的多样化。液泡中的花色苷以互变异构的甲醇假碱、醌式碱、查耳酮假碱以及有色的碱基花色烊正离子4种分子相互平衡的形式存在（任雁和张惟广，2006），糖苷的类型和位置并不会影响花色苷颜色，但液泡pH值的变化会导致花色苷结构变化从而使花色苷颜色发生变化。花色苷抗氧化活性取决于基本骨架B环羟基化程度以及酰化、糖基化的类型和程度。被人体吸收后，可以保护机体免受氧化剂、自由基和低密度脂蛋白胆固醇的侵害。花色苷作为决定植物花色的物质基础，广泛存在于27个科73个属的植物中。目前已知天然存在的花色苷有250多种，在植物中常见的有6种，即天竺葵色素（pelargonidin）、矢车菊色素（cyanidin）、飞燕草色素（delphinidin）、芍药花色素（peonidin）、矮牵牛花色素（petunidin）及锦葵色素（malvidin）（韩海华 等，2011）。这6种常见的花色苷均已在马铃薯中被发现，类型如图1。紫甘薯中的花色苷主要为酰化的矢车菊色素和芍药色素（韩永斌，2007），含量为 180～832 mg·kg-1（FW）（孙健 等，2013）。紫淮山皮中主要的花色苷为飞燕草色素（傅婧，2011），含量为 167～257 mg·kg-1（FW）（王哲和徐皓，2013）。不同基因型马铃薯中花色苷种类和含量不尽相同。Zhang等（2017）研究表明，马铃薯花色苷的总含量为21.27～105.63 mg·kg-1（FW）。红色马铃薯表皮中主要包含天竺葵苷（1 180～1 430 mg·kg-1，FW）和少量芍药苷（75.7～153.4 mg·kg-1，FW）（殷丽琴 等，2015），薯肉花色苷含量为69～350 mg·kg-1（FW）（Brown et al.，2003）；紫色马铃薯表皮中主要包含矮牵牛苷（705～2 030 mg·kg-1，FW）和芍药苷（5.6～569.7 mg·kg-1，FW）（殷丽琴 等，2015），薯肉花色苷含量 为 55～171 mg·kg-1（FW）（Brown et al.，2003；Kita et al.，2015）。

图1 彩色马铃薯中主要的花色苷（Brown et al.，2003）

2 植物花色苷的生物合成

2.1 植物花色苷的生物合成途径

花色苷是通过植物黄酮类化合物生物合成途径分支之一的莽草酸途径合成的，具有高度的保守性，是研究植物基因表达、调控，阐明基因与环境互作调控系统的理想模型（Tanaka et al.，2010）。花色苷合成和代谢的过程在矮牵牛中进行了较为深入的研究（Passeri et al.，2016），基本过程如图2所示。合成过程需要编码酶蛋白的结构基因和编码转录因子的调节基因共同参与，结构基因直接参与花色苷的合成和积累，转录因子调节结构基因的表达，并控制色素的时空合成（Sparvoli et al.，1994；Winkel-Shirley，2001）。花色苷生物合成途径可以分为3个时期。第一时期为多数次生代谢物质共有的苯丙烷途径。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下脱去氨基，形成苯丙烯酸，之后肉桂酸4-羟化酶使其羟基化形成香豆酸，经4-香豆酸辅酶A连接酶的催化作用下形成香豆酸辅酶A。第二时期为类黄酮代谢的关键反应。3分子丙二酰-CoA和1分子4-香豆酸- CoA在查尔酮酶的催化下合成4-羟基查尔酮，再经查尔酮异构酶的作用下转为柚皮素，柚皮素经催化作用形成二氢黄酮醇。第三时期为将无色花色苷变为各种颜色的花色苷。在二氢黄酮醇4-还原酶、花青素合成酶和类黄酮3-O-糖基转移酶的催化下形成蓝色的锦葵素、砖红色的花葵素、紫红色的芍药色素。紫色马铃薯中色素主要来源于矮牵牛素，矮牵牛素可由矢车菊素被甲氧基取代或者由飞燕草素经甲基取代形成，类黄酮 3-羟化酶（F3′H）和类黄酮 3，5- 羟化酶（F3′5′H）是矢车菊素和飞燕草素合成的关键酶，所以有学者认为F3′H和F3′5′H是促使花色苷多样化的主要酶（Naito et al.，1998）。二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）的底物特异性也会影响花色苷的组成和色素的形成。

2.2 植物花色苷合成的主要结构基因

图2 花色苷的生物合成途径（葛翠莲 等，2012）

图3 马铃薯花色苷合成途径

研究表明，花色苷合成过程中编码酶蛋白的结构基因包括PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等（Jaakola，2013）；在双子叶植物中，可分为早期（EBG）、晚期（LBG）生物合成结构基因（图3）。早期生物合成结构基因（CHS、CHI、F3H、F3′H）是参与所有类黄酮生物合成下游常见的类黄酮途径基因。研究表明EBGs基因在紫色甘薯地上器官中都有表达，且在不同品种甘薯中的表达特性相同，不存在显著差异（石晓芳，2013）。IbF3H在紫甘薯块根中表达而白色甘薯块根中不表达（石晓芳，2013）；在紫、白淮山中的表达量则没有显著差异（闫瑞霞 等，2014）；在番茄Aft/Aft突变体（LA1996）中，SlCHS、SlCHI、SlF3H基因的表达与非色素对照基因型无明显差异（Giovanni et al.，2011）。马铃薯块茎中，EBGs在红色和紫色的马铃薯中都有较高的表达（Jung et al.，2005；Liu et al.，2015，2016），即使在同一块茎中，有颜色的部分薯肉中StF3H的表达量也比白色薯肉高（Stushnoff et al.，2010）。

晚期生物合成结构基因包括DFR、ANS、UFGT（Borovsky et al.，2004；Stushnoff et al.，2010；Povero et al.，2011）。 紫甘薯中IbDFR、IbANS表达水平较高，且与花色苷含量呈正比（Mano et al.，2007）。LBGs在淮山中没有一致的表达性，DFR在白淮山中的表达量高于紫淮山，而ANS、UFGT在紫淮山中高度表达，白淮山中基本不表达（闫瑞霞 等，2014）。在许多茄科蔬菜中，LBGs的表达水平与花色苷含量呈显著正相关。辣椒果实发育过程中，幼果期的CaDFR、CaANS和CaUFGT表达上调，即将成熟前达到最大值，在成熟期后出现下调，这与果实的瞬时花色苷积累模式相对应（Borovsky et al.，2004）。彩色马铃薯中StDFR、StANS和StUFGT都有较高表达（André et al.，2009；Jung et al.，2009；Stushnoff et al.，2010；Liu et al.，2015）。

2.3 植物花色苷合成的调控

2.3.1 调控花色苷合成的遗传因素 研究表明，R2R3-MYB转录因子能够上调EBGs和LBGs的表达，并与LBGs的表达正相关。转基因番茄中2种MYB转录因子基因SlANT1、SlAN2的超表达促进 EBGs、LBGs和SlAN1（bHLH）相关基因的表达，使花色苷大量积累，其中SlANT1的促进作用比SlAN2更明显。但SlANT1、SlAN2对bHLH类转录因子基因SlJAF13、WD40类转录因子基因SlAN11的表达量无促进作用（Mathews et al.，2003；Schreiber et al.，2012；Kiferle et al.，2015；Meng et al.，2015）。辣椒中发现CaMYBA可以促进CaDFR和CaANS的表达。马铃薯块茎中的StAN2对DFR和F3′5′H启动子有明显的激活作用（Jung et al.，2009）。紫甘薯块根中特异表达的IbMYB1可与结构基因IbANS启动子上的MYBCORE和MYBST2元件发生特异性结合（Dong et al.，2014），并产生IbMYB1a、IbMYB1b两种不同的转录本，其中IbMYB1a表达尤为明显（Chayoung et al.，2010）。将IbMYB1a在转基因烟草叶片中过表达可导致花色苷合成途径结构基因表达水平上调，大量积累花色苷（Kim et al.，2010）。

植物中，主要有AN1、JAF13两类bHLH转录因子参与花青素生物合成的调控，有观点认为它们不能相互交换，并参与花青素调节的不同步骤（Spelt et al.，2000）。对马铃薯的研究中发现单一StbHLH1的表达不足以调节花青素的生物合成，需要StJAF13的激活，才能调控花色苷的生物合成（Liu et al.，2015，2016，2017）。WD40是另一类重要的转录因子，马铃薯块茎中WD40转录因子，不依赖于AN1、AN2，很可能调控AN2，在mRNA水平调控AN2的后转录，从而控制DFR基因表达（罗遵喜 等，2008）。在白肉马铃薯中转入StAN11，可使块茎颜色明显加深（刘仕芸，2007）。Zhang等（2003）研究表明，拟南芥bHLH的调控作用需要TTG1（WD40）的参与；Suganuma等（2008）认为WD40通过组蛋白修饰参与染色质重塑，从而发挥对转录的影响过程。

大量研究表明，花色苷生物合成途径受MYB-bHLH-WD40（MBW）复合物调控（Ramsay & Glover，2005）。MYB转录因子主要通过与结构基因启动子结合决定对MBW复合物的激活或抑制作用，分为MYB激活剂、MYB抑制剂（Koes & Verweij，2005）；bHLH转录因子决定了识别靶基因启动子中转录因子结合位点和激活转录的特异性（Montefiori et al.，2015）；WD40蛋白为MYB和bHLH蛋白形成MBW复合物提供了一个稳定的平台。AN1可通过MYB-AN1-WD40复合物直接激活花青素生物合成途径，而JAF13需要通过形成MYB-JAF13-WD40复合物激活AN1活性调节该通 路（Montefiori et al.，2015）。R2R3-MYB 激 活剂首先与JAF13、WD40形成MYB-JAF13-WD40复合体，激活AN1，之后AN1代替 JAF13，形成MYB-AN1-WD40复合体调控相关结构基因的表达（Liu et al.，2015，2016，2017）。此外，植物转录因子家族中也存在极少的花色苷合成的负调控因子。矮牵牛中有两类MYB转录因子R2R3-MYB和R3-MYB抑制子被证明降低了花青素的生物合成。R2R3-MYB在C端含有1个抑制基序，而R3-MYB中不含有此结构。两种抑制剂都可以与MBW复合物中的bHLH蛋白偶联，被动抑制花青素的生物合成。R2R3-MYB可以通过抑制基序主动与目的基因启动子结合，抑制下游基因的转录过程，如PhMYB27抑制PhAN1的表达（Albert et al.，2011），而与 AtCPC 同源的 PhMYBx（R3-MYB）通过与PhAN1和PhJAF13结合，抑制花青素的合成（Koes & Verweij，2005；Zhu et al.，2009）。MYB抑制剂与MYB激活剂竞争与JAF13和AN1结合，从而减少MBW复合物的数量。除了MYB抑制剂外，还发现microRNAs在转录后水平抑制花青素的生物合成。在番茄中miRNA858抑制了R2R3-MYB激活剂的表达（Jia et al.，2015）。

2.3.2 植物花色苷合成的环境调控 花色苷的合成积累受光影响较大，光照强度和波长都会不同程度地影响花色苷合成过程，但波长起着更为关键的作用（胡可 等，2010）。研究发现，强光调控花色苷的产生主要是通过调控R2R3-MYB转录因子来实现（Albert et al.，2009），茄属植物中R2R3-MYB转录因子SlAN2在强光下可引导番茄中的花色苷含量上升（Kiferle et al.，2015），辣椒中CaMYBA在强光下表达量上调（Lightbourn et al.，2007），致使花色苷含量增加；R2R3-MYB抑制剂PhMYB27在强光下表达量下调（Albert et al.，2011），促进矮牵牛花色苷合成。光质对花色苷生物合成基因的影响在茄科蔬菜中的研究较少，但在矮牵牛中，蓝光和红光与黑暗条件相比，可以诱导CHS基因表达（Katz & Weiss，1999）。MYB类转录因子中一部分受环境影响，光通过激活光敏色素PHY、隐花色素CRY、光受体UVR8控制COP1从而影响MYB类调控因子的表达，目前尚无明确证据表明COP1是否受其他环境因素影响果实中花色苷的生物合成（图4）。蓝光在欧洲油菜中诱导BnCRY1基因的转录，长时间的蓝光照射使得积累的CRY 1蛋白水平较低，花色苷含量下降（Chatterjee et al.，2006）。烟草叶片中花色苷生物合成基因在光照下上调表达，在黑暗中下调表达。烟草CaMV35S启动子控制马铃薯StMYBA1基因在烟草叶片中的瞬时表达（Liu et al.，2017）。在整个生育期中用不同的光照条件对紫色马铃薯进行照射，4 h光照处理下紫色马铃薯块茎成熟期苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性较2 h光照处理提高了2.74%，且PAL活性和光照强度、时间呈正相关，证明了光影响PAL活性，从而影响紫色马铃薯中花色苷的含量（吴翠萍，2016）。

图4 果树花色苷生物合成发育与环境调控的简化模型（Jaakola，2013）

温度是影响花色苷代谢的另一个主要环境因素，高温影响花色苷合成相关酶的活性，促进花色苷的水解。研究表明，植物在碳水化合物不足时，会使花色苷的糖苷键水解，为植物提供能量，导致植物有高温褪色的现象（罗兰，2007）。高温下苹果内花色苷浓度的降低可能与Ⅲ类过氧化物酶活性的提高和过氧化氢水平的升高有关。然而，通过过氧化物酶抑制剂，尽管高温下过氧化氢水平较高，但35 ℃处理的花色苷含量增加甚至高于20 ℃处理。因此，过氧化物酶活性的提高有助于降低高温下花色苷的含量（Niu et al.，2017）。在茄子的研究中发现，EBGs（SmCHS、SmCHI、SmF3H）比LBGs（SmF3′5′H、SmDFR、SmANS）对低温的反应更敏感（Jiang et al.，2016）。长日照处理下的彩色马铃薯块茎成熟期花色苷含量较短日照处理提高了1.93%（吴翠萍，2016）。高温主要抑制紫甘薯下游基因DFR和F3H的表达，对CHS的影响较小（李国良 等，2017）。

激素在花色苷的合成及调控机制中也起着十分重要的作用。Weiss等（1992）在矮牵牛花冠中发现，脱落酸可以诱导CHS、CHI、DFR、ANS基因的表达，促进花色苷的形成。但在Ronchi等（1997）的研究中呈相反的结果，脱落酸抑制玉米中花色苷的积累。研究表明，脱落酸可以通过抑制植物体中叶绿素降解来抑制花色苷的合成，叶绿素吸收较多的红光，与光敏色素形成竞争机制，降低光敏色素的效应，从而影响花色苷的合成（Looney，1980）。使用激素和糖处理拟南芥种子发现，施加赤霉素（GA）后，糖诱导的花青素苷合成途径被抑制；而茉莉酮酯酸（jasmonic acid，JA）和脱落酸（abscisic acid，ABA）却能与糖协同作用于花青素苷合成途径（Loreti et al.，2008）。乙烯可以促进PAL的活性，同时增加细胞膜的透性，促进糖运转速率，利于花色苷合成（李平 等，1999）。在植物体花色苷的合成过程中并不取决于某种单一的激素的作用，而是取决于各种激素的某种平衡。激素之间起着增效、拮抗、诱导和反馈等作用，在植物体内共同调节花色苷的合成过程。

3 展望

花色苷具有较高抗氧化能力、较好的光稳定性和热稳定性，在保健、化妆品和医药行业中有广泛的应用前景。但花色苷合成基因在不同物种、不同器官和组织之间具有时空表达差异性，受不同MYBs组成的MBW复合物控制。紫甘薯、彩色马铃薯等块根块茎类作物花色苷含量高，应用前景大，但是有关其花色苷生物合成相关转录因子及其调控的分子机制尚不明确，地下器官花色苷生物合成相关关键基因的克隆与利用及分子调控机制的解析仍将是将来研究的重点，研究结果不但可以丰富植物花色苷生物合成调控机理的理论，同时为加速培育高花色苷作物新品种提供理论指导和基因资源。随着分子生物学技术的发展，采用基因组、转录组、蛋白组、代谢组学、基因编辑等技术，对高花色苷含量的紫甘薯、彩色马铃薯资源进行深入研究，挖掘地下器官花色苷关键合成基因及调控基因，通过遗传操作调控花色苷的合成、提高植物地下器官的花色苷含量和产量已成为可能。