奚 萌 周建新 葛志文 戚馨月

(南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

稻谷居我国三大主粮之首，在粮食安全中占重要地位。稻谷储藏期间，由于受到储藏条件的影响，易发生微生物特别是霉菌活动而发生霉变，给储藏安全构成威胁。据联合国粮农组织 FAO统计，全球大多数发展中国家每年由于霉菌和储粮害虫造成的粮食产后损失至少在 10%～15%[1]。

国内外有关稻谷储藏过程中微生物活动与品质变化规律的研究已取得一定进展。田海娟等[2]的研究表明稻谷储藏期间受温湿度的影响会引起微生物活动加剧的现象，储藏环境相对湿度超过80%，微生物活动显著增加，相对湿度超过90%，稻谷品质受到显著影响，粮层对湿度扩散有显著的阻挡作用。周建新等[3]通过模拟储藏，表明储藏水分和温度越高，稻谷霉菌量增长越快，并且曲霉是优势霉菌；霉菌量在104CFU/g以下，稻谷处于安全储藏状态，达到105CFU/g时，稻谷开始霉变，其值变化与霉菌演替有显著相关性。杨基汉等[4]研究了高湿条件下温度对储藏稻谷水分和脂肪酸值的影响，结果表明储藏环境的温度和时间对稻谷的水分和脂肪酸值有显著性影响，85%高湿条件下，随着储藏温度的升高和时间的延长，水分呈先上升、平稳、后下降的趋势，方差分析得出储藏环境的温度和时间对稻谷的水分有显著影响。林镇清等[5]的研究表明，在实仓中，稻谷水分随储藏时间延长而逐渐降低，且表层水分低于上层水分，粮堆内部粮食水分变化较小。Laca等[6]研究了霉菌在谷物中的分布，表明霉菌主要分布在谷粒表层，通过去除谷物外壳可显著减少微生物污染。Genkawa等[7]研究了不同含水量稻谷储藏过程中脂肪酸值、发芽率和霉菌活动的变化，表明低水分稻谷无霉菌生长，其储藏的效果同低温储藏一样有效。上述的研究结果多基于实验室模拟储藏或实仓混样得到的研究结果，但由于环境温、湿度的变化，储藏稻谷粮堆内的水分转移，从而使稻谷不同粮层霉菌活动不尽相同，防霉、控霉有一定的盲目性。本文研究了高大平房仓中稻谷粮堆不同层微生物在储藏过程中的变化规律，为储藏稻谷的精准防霉和控霉提供依据。

1 材料与方法

1.1 稻谷样品采集

中储粮泰州仓储有限责任公司，17号仓，高大平房仓，当地产2016年粳稻谷，2016年12月成货位，粮堆高7.3米。2017年5月26日第一次取样，此后每3个月取样一次，共取样4次。采用三层五点取样法，分别以距粮堆表面0.5 m，粮堆中央层及距地面0.5 m为上层，中层，下层。每层以距粮仓东南角、东北角、西南角、西北角1米处及中央点作取样点。即全仓共15个取样点，每点取样200 g，无菌采样袋密封取回，实验室中低温保存。每个取样点各称取50 g于无菌均质袋中，分别做每层的混样及全仓总混样的检测。

1.2 培养基

高盐察氏琼脂：北京陆桥技术责任有限公司；察氏琼脂、平板计数琼脂：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.3 主要仪器与设备

LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器；101-3AS型电热鼓风干燥箱；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜；GNP-9160型隔水式恒温培养箱；ZQTY-70S型大容量低温摇床；JE1001型电子天平；HH-M8型八孔水浴锅；ZEISS Scope A1型正置荧光显微镜；ABI3730XL型基因测序仪。

1.4 指标及其测定方法

霉菌量：参照GB4789.15—2016，选用高盐察氏琼脂培养基，28 ℃培养6d后观察结果。用察氏琼脂培养基平板进行霉菌分离与纯化；采用形态特征[8-10]与分子生物学技术[11-12]相结合进行菌种鉴定。细菌量：参照GB4789.2—2016；水分测定：参照GB 5009.3—2016。

1.5 数据处理

每次实验设定3组平行，每组实验重复3次。使用EXCEL对测定数据作图， SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 稻谷粮堆储藏过程中水分变化规律

稻谷储藏过程中水分含量的变化情况如图1所示，4次取样时间分别对应稻谷初始储藏，储藏90，180，270 d。由图可知，该仓稻谷水分含量在14.1%-14.5%之间，低于安全水分，稻谷粮堆下层及全仓混样水分含量随储藏时间的延长呈下降趋势。稻谷粮堆上层与中层水分含量随储藏时间的延长先降低后略微增加。以层次来看，相同储藏时间内，稻谷水分含量中层>下层>上层。由于储藏过程中水分迁移及通风技术的影响，下层稻谷水分向中层与上层迁移，中层最易受影响，故中层稻谷水分含量最高，粮层对湿度扩散有显著的阻挡作用[2]且上层稻谷受外界环境影响较大水分易挥发故水分含量最低[5]。

以储藏时间和粮层位置两因素作变异源，进一步对稻谷水分含量作方差分析，如表1所示，因素“粮层位置”F=1.745，自由度df1=3,df2=32,和显著性水平α=0.05，查表得F0.05(3,32)=2.90。由于实得F>F0.05(3,32)表明不同粮层间稻谷水分含量有显著差异。因素“储藏时间”F=5.426由于实得F>F0.05(3,32)表明不同储藏时间稻谷水分含量存在显著性差异。粮层位置和储藏时间的交互作用下稻谷水分含量有著性差异(P=0.000)。说明粮层位置与储藏时间均对稻谷水分含量有显著影响。

图1 稻谷粮堆各层水分含量变化规律

F5.678E-631.893E-612.1320.0002.438E-538.127E-65.4260.004∗7.233E-598.036E-75.1510.000e0.000321.560E-70.97448

2.2 稻谷粮堆储藏过程中霉菌量演替规律

稻谷储藏过程中霉菌量的演替情况如图2所示，由图可知，稻谷粮堆上层、中层、下层及全仓混样霉菌量随着储藏时间的延长，呈先增加后逐渐减少的趋势。从层次来看，在同一储藏时间，稻谷霉菌量上层>中层>下层。

以储藏时间和粮层两因素作变异源，进一步对稻谷霉菌量作方差分析，如表2所示，因素“粮层位置”F=29.778，自由度df1=3，df2=32和显著性水平α=0.01，查表得F0.01(3,32)=4.46。由于实得F>F0.01(3,32)，表明不同粮层间霉菌量有极显著差异。因素“储藏时间”F=147.039，由于实得F>F0.01(3,32)，表明不同储藏时间稻谷霉菌量存在极显著差异。粮层和储藏时间的交互作用下稻谷粮堆霉菌量达到极显著性差异(P=0.000)。说明稻谷粮堆的粮层位置与稻谷储藏时间对霉菌量均有显著性影响。

图2 稻谷粮堆各层霉菌量演替规律

F 8 207 500.0003 2 735 833.33329.7780.0004.053E731.351E7147.0390.000∗8 684 166.6679964 907.4110.5020.000e2 940 000.0003291 875.0005.130E848

2.3 稻谷粮堆储藏过程中优势霉菌演替规律

2.3.1 优势霉菌的分离与鉴定

对培养出的各菌株编号，并分别计算各菌的百分比，列出优势菌。各菌种于察氏培养基中进行分离培养。观察菌落形态和菌体特征，并以ITS1与ITS4作特征引物，提取基因组DNA，合成引物，扩增ITS区全序列，扩增结果如图3所示。采用胶回收方法对PCR产物纯化，使用基因测序仪进行测序，在GenBank数据库中Blast测序结果。通过Blast对比结果并结合菌落形态与无性繁殖体特征，确定3株优势菌分别为黄曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黑曲霉。

图3 ITS区全序列扩增结果

2.3.2 稻谷粮堆储藏过程中优势霉菌演替规律

稻谷储藏过程中优势霉菌演替如表3所示。由表可知，储藏开始时，全仓混样、中层和下层优势霉菌均为阿姆斯特丹曲霉、黄曲霉和黑曲霉(按带菌量所占百分比由高到低排列)，随着储藏时间的延长，阿姆斯特丹曲霉所占比例呈增加趋势，黄曲霉所占比例呈下降趋势，黑曲霉基本不变。上层优势霉菌分别为黄曲霉、阿姆斯特丹曲霉和黑曲霉(按比例由高到低排列)，但随储藏时间的延长，阿姆斯特丹曲霉逐渐取代黄曲霉成为最主要优势霉菌，黄曲霉与黑曲霉所占比例大致呈下降趋势。储藏结束时，各粮层的优势霉菌种类趋于相同，所占比例基本一致。

表3 稻谷粮堆储藏过程中优势霉菌百分比变化(%)

2.4 稻谷储藏过程中细菌量的演替规律

稻谷储藏过程中细菌量的演替情况如图4所示，由图可知稻谷粮堆上层、下层及全仓混样细菌量随储藏时间的延长呈逐渐减少趋势。稻谷粮堆中层，细菌量随储藏时间延长呈先增加后逐渐减少趋势。从层次来看，在同一储藏时间，稻谷细菌量中层>下层>上层。

以储藏时间和粮层位置两因素作变异源，进一步对稻谷细菌量作方差分析，结果如表4所示，因素“粮层位置”F=16.304，自由度df1=3，df2=32，和显著性水平α=0.01，查表得F0.01(3,32)=4.46。由于实得F>F0.01(3,32)，表明不同粮层间细菌量有极显著差异。因素“储藏时间”F=453.062，由于实得F>F0.01(3,32)，表明不同储藏时间稻谷细菌量存在极显著差异。粮层位置和取样时间的交互作用下稻谷细菌量达到极显著性差异(P=0.000)。说明表明稻谷粮堆的粮层位置与稻谷储藏时间对细菌量均有显著性影响。

图4 稻谷粮堆各层细菌量演替规律

F1.351E834.503E716.3040.0003.754E931.251E9453.0620.000∗1.410E891.567E75.6740.000e8.839E7322 762 083.331.023E1048

2.5 稻谷粮堆储藏过程中微生物区系变化规律讨论

图5 稻谷粮堆各层均温及仓温变化图

稻谷储藏过程中各粮层粮温及仓温变化如图5所示，稻谷粮堆上层粮温与全仓粮温均温自初始储藏至储藏90天期间上升，后逐渐下降。中层与下层稻谷粮温自初始储藏至储藏180天期间上升，储藏180天至270天之间粮温下降。由于稻谷粮堆上层易与外界空气接触，故粮温与仓温间差距较小。中层与下层难与外界空气接触，故粮温存在滞后效应，在储藏90天至180天之间，仓温急剧下降，中层与下层稻谷粮温反增。

霉菌与细菌的生长均需要充足水分与适宜温度。稻谷的初始水分较低，处于安全水分以下，随储藏时间延长而有所下降，但变化率小。粮温在储藏过程中变化较明显，故霉菌量受粮温影响较大。初始储藏至储藏90天稻谷粮温明显升高，全仓均温由12 ℃升至16.7 ℃，故各层霉菌量明显增加，其后粮温降低，霉菌量随之减少。上层稻谷粮温普遍高于其他粮层，所以上层稻谷霉菌量最多。随储藏时间延长，各层阿姆斯特丹曲霉比例增加，成为最主要的优势霉菌，黄曲霉比例降低，黑曲霉比例几乎不变。由于阿姆斯特丹曲霉适宜在低水分环境繁殖，黄曲霉为中生性，黑曲霉为接近高温、高湿的霉菌[9]，所以对阿姆斯特丹曲霉生长的影响远小于对黄曲霉、黑曲霉生长的影响。细菌为湿生性微生物，对水分要求较高，故储藏过程中稻谷细菌量受稻谷水分含量影响较大随水分含量降低呈下降趋势。中层稻谷水分含量最高，所以中层稻谷细菌量最多。

3 结论

稻谷的初始水分较低，储藏期间水分含量为14.1%-14.5%,处于安全水分以下。随储藏时间的延长，稻谷粮堆各层水分逐步降低霉菌量先增加后减少，细菌量呈逐步减少的趋势。储藏同一时间，稻谷霉菌量上层>中层>下层，细菌量中层>下层>上层。进一步方差分析表明粮层位置与储藏时间对霉菌量与细菌量均有显著影响。由于稻谷水分含量变化率较小，霉菌受粮温影响较大，故随粮温升高先增加后随粮温降低而减少。细菌为湿生性微生物，受稻谷水分含量影响较大，储藏过程中稻谷水分含量降低，故细菌量减少。储藏开始时，上层的最主要优势霉菌为黄曲霉，中、下层的最主要优势霉菌为阿姆斯特丹曲霉，随储藏时间的延长，各层的阿姆斯特丹曲霉比例增加，其比例超过40%，为最主要的优势霉菌,黄曲霉比例降至22%左右，黑曲霉比例几乎不变约为17%。原因是阿姆斯特丹曲霉为干生性曲霉，而黄曲霉、黑曲霉属于中生性或湿生性霉菌，对阿姆斯特丹曲霉生长的影响远小于对黄曲霉、黑曲霉生长的影响。